【摘要】：目的:腎癌,是全球十大惡性腫瘤之一,居泌尿系統(tǒng)第二大腫瘤疾病,該疾病的全球發(fā)病率和死亡率每年上升2%-3%。它主要來源于腎實質(zhì),以透明細胞癌最為常見,其占所有腎癌類型的75-80%。早期腎癌無癥狀且不易被發(fā)現(xiàn),晚期腎癌患者可出現(xiàn)患者出現(xiàn)腰痛、血尿、腹部包塊等癥狀。在診斷為腎癌的所有患者中,20-30%患者已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移,這些患者在行手術(shù)治療后仍有30%比例患者出現(xiàn)疾病進展。但是如果在疾病早期能夠發(fā)現(xiàn)腎癌并進行干預(yù),患者的5年生存率可以達到90%。目前,已報道的幾種腎癌相關(guān)預(yù)測因子,由于其個體異質(zhì)性及測定敏感度等方面的原因并無法廣泛引用于臨床中,因此尋找腎癌治療的新靶標及腫瘤預(yù)測因子,成為近年來的主要研究熱點。組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)是乙�；匾墓δ艿鞍酌�,它能把乙酰輔酶A的乙�；D(zhuǎn)移到組蛋白N端特定的賴氨酸殘基上,又被稱為賴氨酸乙�；D(zhuǎn)移酶(lysine acetyltransferase,Kat)。Kat7(lysine acetyltransferase 7,Kat7)作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的一個亞基,參與細胞內(nèi)的復(fù)雜的生物學(xué)功能,包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡等。作為HATs家族的一份子,Kat7是多種蛋白復(fù)合物的催化亞基,其中包括腫瘤抑制蛋白Ing4/5、JADE-1蛋白等,并能乙�；M蛋白H4,也能作為Cdt1的共激活子參與復(fù)制起始調(diào)節(jié);尤其是Kat7在DNA復(fù)制起始中可能作為復(fù)制因子Cdt1的共刺激因子起作用,Kat7也對細胞復(fù)制周期中的S期起重要作用。Kat7在多種原發(fā)癌中表達增加,包括乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌及前列腺癌等。但是Kat7在腎癌中的尚未有明確報道,且對其腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的分子機制尚缺乏一定的認識。內(nèi)容:首先,我們對腎癌患者病理標本進行Kat7檢測,分析并統(tǒng)計其臨床意義;其次,通過對Kat7進行體內(nèi)外實驗研究,探究Kat7對腎癌生長的影響;最后,通過研究Kat7與細胞周期蛋白cyclin B1的關(guān)系,尋找該分子調(diào)控腎癌生長的部分機制。方法:首先,通過免疫組化及預(yù)后生存曲線分析Kat7與腎癌患者預(yù)后關(guān)系;其次,分別利用生長曲線、克隆形成實驗及裸鼠成瘤實驗,研究Kat7對腎癌生長的影響;最后,采用RT-PCR、免疫共沉淀實驗、蛋白免疫印跡實驗、蛋白酶體抑制等實驗,研究Kat7對cyclin B1之間的調(diào)控作用。結(jié)果:首先,我們利用免疫組化對本單位收集的55名腎癌患者病理標本進行檢測,Mann-Whitney U秩和檢驗比較癌組織和癌旁組織間Kat7表達差異,結(jié)果表明腎癌與癌旁正常組織中Kat7的表達量存在差異,且腎癌組織中Kat7的表達量高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;通過Kaplan-Meier生存曲線分析可知Kat7表達越高的腎癌患者無疾病生存期及總生存期越短。其次,在體外細胞實驗中通過轉(zhuǎn)染慢病毒包裝質(zhì)粒p CDH-Kat7構(gòu)建的穩(wěn)定786-O腎癌細胞克隆,與其對照組腎癌細胞比較,CCK8結(jié)果說明轉(zhuǎn)染p CDH-Kat7質(zhì)粒的786-O細胞組增殖能力上升,克隆形成實驗說明轉(zhuǎn)染p CDH-Kat7質(zhì)粒的786-O腎癌細胞集落數(shù)較對照組明顯增多;而且通過比較敲除Kat7的Caki-1細胞與其裸細胞,生長曲線提示敲除Kat7的腎癌細胞Caki-1生長受到抑制。為進一步分析Kat7與腎癌細胞生長之間的關(guān)系,我們分別利用慢病毒過表達Kat7的786-O穩(wěn)定克隆及敲除Kat7腎癌細胞Caki-1與它們各自的對照細胞比較,通過流式細胞儀分析說明了Kat7的表達能夠促進腎癌細胞由G2期到M期的轉(zhuǎn)換,從而促進腎癌細胞的增殖,蛋白免疫印跡實驗提示Kat7的過表達促進cyclin B1蛋白的表達;反之,Kat7敲除能夠抑制Caki-1細胞由G2期過渡到M期,最終阻滯了Caki-1細胞的生長增殖。為深入研究Kat7與cyclin B1在細胞內(nèi)的相互作用,我們用Myc空載體質(zhì)粒及Myc-Kat7質(zhì)粒分別與Flag-cyclin B1共同轉(zhuǎn)染入293T細胞,收集細胞裂解物分別與Myc-beads偶聯(lián),進行免疫共沉淀行Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)Myc-Kat7蛋白能被G2/M期的cyclin B1特異性富集。為進一步探索了Kat7與cyclin B1蛋白之間的直接相互作用,我們通過純化GST-cyclin B1融合蛋白,與轉(zhuǎn)染Myc-Kat7的786-O及Caki-1細胞裂解產(chǎn)物孵育,通過GST pull-down實驗發(fā)現(xiàn)Kat7蛋白與cyclin B1在體外具有直接且特異的相互作用。接下來為明確Kat7基因調(diào)控cyclin B1的具體機制,我們通過RT-PCR技術(shù)驗證Kat7對cyclin B1的調(diào)控,收取Kat7過表達樣品,將其一分為二,其中一份樣品通過蛋白免疫印跡實驗驗證Kat7的蛋白表達,另外一份樣品通過提取RNA,并進行反轉(zhuǎn)錄合成c DNA,最后通過RT-PCR儀檢測過表達Kat7及其與對照組cyclin B1的m RNA含量,與對照組比較,高表達Kat7組中cyclin B1的m RNA水平保持一致,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義;同理,敲低Kat7的Caki-1腎癌細胞樣品中的m RNA水平與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。為進一步驗證Kat7蛋白對cyclin B1的蛋白具有降解作用,通過比較正常對照細胞與敲低Kat7的786-O及敲除Kat7的Caki-1腎癌細胞中cyclin B1蛋白的表達,收取細胞裂解產(chǎn)物,加入蛋白合成抑制劑的放線菌酮實驗,在不同時間點收取細胞裂解產(chǎn)物,Western blotting檢測結(jié)果說明敲低Kat7的786-O細胞周期蛋白cyclin B1的半衰期縮短。為研究Kat7參與cyclin B1蛋白降解的作用方式,分別收取Kat7敲低的786-O及敲除Kat7的Caki-1的細胞裂解物,其中一組樣品在收取細胞裂解產(chǎn)物之前加入蛋白酶抑制劑MG132作用后,通過Western blotting檢測cyclin B1蛋白,結(jié)果說明蛋白酶抑制劑能夠抑制Kat7對cyclin B1蛋白的降解。為驗證Kat7的體內(nèi)對腎癌細胞生長的影響,通過裸鼠成瘤實驗發(fā)現(xiàn)敲除Kat7的Caki-1細胞植入裸鼠體內(nèi)的腫瘤形成能力明顯弱于對照組動物腎癌腫瘤模型動物。結(jié)論:Kat7在腎癌中的表達高于癌旁,且與預(yù)后呈負相關(guān);Kat7能夠通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)控cyclin B1周期蛋白,進而調(diào)控腎癌生長。本實驗說明Kat7在腎癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用,該基因很可能成為新的預(yù)預(yù)測因子及治療靶點,通過針對該靶點藥物的研發(fā),抑制該基因的表達,從而抑制腎癌細胞的生長,這將為將來腎癌的治療提供新的治療策略。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.11
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本文編號：2438311