【摘要】：研究目的檢測軟脂酸（PA）對腎小管上皮細胞Toll樣受體4（TLR4）及其下游炎癥因子IL-6和TNF-ɑ表達的影響，探討游離脂肪酸（FFAs）在引發(fā)腎臟微炎癥反應(yīng)的相關(guān)作用機制。 實驗方法用含有軟脂酸濃度為（0μ mol/L、125μ mol/L、250μ mol/L、500μ mol/L）的DMEM培養(yǎng)液對正常的大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）進行干預(yù)。①于干預(yù)24小時后觀察NRK-52E的形態(tài)學的變化；②采用MTT法檢測不同濃度的軟脂酸干預(yù)12h,24h后NRK-52E的增殖情況；③相同條件下培養(yǎng)細胞12h，，24h，應(yīng)用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)檢測腎小管上皮細胞TLR4mRNA水平；④用流式細胞術(shù)儀(flow cytometry，F(xiàn)C)檢測軟脂酸干預(yù)24小時后NRK-52E表面TLR4的蛋白水平；⑤采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測軟脂酸作用12h，24h后不同濃度組上清液中白介素-6（IL-6）與腫瘤壞死因子-α （TNF-ɑ）的表達情況。 主要結(jié)果 1.NRK-52E細胞形態(tài)正常NRK-52E細胞為類圓形的貼壁細胞,鋪滿、融合后細胞呈鋪路石狀貼壁生長。經(jīng)24小時不同濃度軟脂酸干預(yù)后,由緊密連接的類圓形細胞拉長為連接松散的梭形細胞,其中500μ mol/L濃度的軟脂酸干預(yù)后細胞變化尤為明顯。 2.MTT檢測細胞增殖細胞處理12h，24h終點時：d-BSA組與空白對照組相比，無統(tǒng)計學差異（p0.05），說明d-BSA作為軟脂酸與NRK-52E細胞結(jié)合的載體，對NRK-52E細胞的增值不產(chǎn)生有意義的影響；各軟脂酸組與空白對照組比較，OD值明顯減小，且有顯著的統(tǒng)計學差異(P0.01)；三組不同濃度軟脂酸組之間兩兩比較，OD值隨著軟脂酸濃度的增加逐漸減小，且各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。相同濃度組不同時間段比較：24小時較12小時OD值有所降低，且各組均有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 3.PCR檢測結(jié)果細胞處理12小時結(jié)果：不同組之間細胞內(nèi)TLR4的mRNA表達量總體有差別，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PA125μ mol/L組與d-BSA對照組相比TLR4的mRNA表達上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PA250μ mol/L組與d-BSA對照組及PA125μ mol/L組相比TLR4的mRNA表達上調(diào)，但與PA125μmol/L組之間差異無統(tǒng)計學意義，可能在軟脂酸干預(yù)的早期，這兩組濃度軟脂酸不足以引起TLR4的mRNA的差異性表達；PA500μ mol/L組與其它任意組比較，TLR4的mRNA表達明顯上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；綜上說明在干預(yù)12小時終點時，TLR4的mRNA表達隨著軟脂酸濃度增高而增加，且在500μ mol/L濃度時其表達更是明顯增加。細胞處理24小時結(jié)果：不同組之間細胞內(nèi)TLR4的mRNA表達量總體有差別，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PA125μ mol/L組與d-BSA對照組相比、PA250μ mol/L組與PA125μ mol/L組相比、PA500μ mol/L組與PA250μ mol/L組相比表達均上調(diào)，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明在干預(yù)24小時終點時，TLR4的mRNA表達與軟脂酸的濃度之間呈一定的濃度依賴關(guān)系。相同濃度組不同時間段比較：24小時較12小時表達有所增高，其中PA250μ mol/L組與PA500μ mol/L組均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。 4.流式細胞儀檢測結(jié)果不同濃度的軟脂酸處理腎小管上皮細胞24h后，與對照組相比細胞膜TLR4蛋白水平明顯增高，并隨濃度增高而增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），三組不同濃度軟脂酸組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.ELISA方法檢測結(jié)果細胞處理12h，24h終點時：d-BSA組與空白對照組上清液中可檢測到微量IL-6、TNF-ɑ，兩組相比，差異無統(tǒng)計學意義（p0.05）；12小時低濃度IL-6組與空白對照組比較，分泌有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義（p0.05）；其余各軟脂酸組干預(yù)組與空白對照組比較且各組兩兩比較，有的統(tǒng)計學差異(P0.05)，且IL-6、TNF-ɑ的分泌隨PA濃度的增加明顯增多；相同的處理濃度，干預(yù)24小時組較干預(yù)12小時組IL-6、TNF-ɑ的分泌明顯增多，且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 主要結(jié)論 1.腎小管上皮細胞的生長、增殖受到軟脂酸作用的影響。并且在12h及24h，0μ mol/L-500μ mol/L濃度范圍內(nèi)軟脂酸的濃度與細胞的增殖呈負相關(guān)。 2.軟脂酸可誘導腎小管上皮細胞TLR4mRNA的表達增高。 3.軟脂酸誘導腎小管上皮細胞膜上TLR4蛋白的表達增高。 4.軟脂酸可以促進腎小管上皮細胞IL-6及TNF-α的分泌，且IL-6、TNF-α分泌的高峰與TLR4mRNA及在細胞膜上蛋白表達的高峰基本接近，提示IL-6、TNF-α的增高可能與細胞膜上TLR4蛋白的表達有關(guān)，進一步推論，可能是軟脂酸通過作用TLR4而間接促發(fā)炎癥因子IL-6、TNF-α的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692

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本文編號：2417955