【摘要】：第一部分：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)無精子癥小鼠睪丸特異性基因表達(dá) 目的 在生殖男科領(lǐng)域,探索人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs)對無精子癥的治療作用,通過移植HUCMSCs進(jìn)入無精子癥小鼠模型,檢測生殖細(xì)胞特異性基因的表達(dá),證實(shí)生殖細(xì)胞特異性基因的表達(dá)上調(diào),從而表明HUCMSCs對睪丸生精功能的恢復(fù)可能具有促進(jìn)作用。由此探索一條治療無精子癥的新途徑。 方法 1、無精子癥小鼠模型的建立 雄性8周齡BALB/C小鼠80只,采用腹腔內(nèi)單次注射白消安35mg/kg。注射白消安后的第5周,切取5只小鼠的睪丸,HE染色后,觀察睪丸的生精上皮結(jié)構(gòu)變化,確定模型的構(gòu)建情況。剩余存活小鼠用于細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。 2.HUCMSCs的原代培養(yǎng)及鑒定 在獲得知情同意書的前提下,取不同個體來源的臍帶組織分別處理,PBS洗滌,獲得華通氏膠,采用組織塊法,將組織剪碎成1mm3大小,并貼于培養(yǎng)瓶內(nèi),根據(jù)干細(xì)胞本身的貼壁能力,將細(xì)胞培養(yǎng)在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。每3-4天換液。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%,進(jìn)行細(xì)胞傳代。收取培養(yǎng)的第三代HUCMSCs用于移植實(shí)驗(yàn)。HEK293細(xì)胞作為對照組,同時進(jìn)行正常培養(yǎng)。對生長良好的第三代]HUCMSCs進(jìn)行鑒定,采用流式細(xì)胞術(shù),分別檢鋇FITC-CD73, PE-CD105,ACP-CD31等表面抗原標(biāo)志物的表達(dá)。通過G顯帶技術(shù)對第三代HUCMSCs進(jìn)行核型分析。對第三代HUCMSCs分別進(jìn)行成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)21天后,分別使用茜素紅和油紅O,對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行染色。 3.HUCMSCs移植進(jìn)入無精子癥小鼠模型睪丸 取第三代HUCMSCs用于移植實(shí)驗(yàn)。注射濃度為1×107cell ml-1。取40只構(gòu)建成功的無精子癥模型小鼠,隨機(jī)分為4組,每組10只：第一組不注射作為空白對照組；第二組注射生理鹽水作為陰性對照組；第三組注射HEK293細(xì)胞；第四組注射HUCMSCs。注射部位均為左側(cè)睪丸,右側(cè)睪丸不作處理設(shè)為對照。每次注射劑量為10μl。 4、睪丸特異性基因表達(dá)的檢測 分組移植后第三周,于每組各取5只小鼠,取雙側(cè)睪丸組織,分別提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄之后,對生殖細(xì)胞特異性的、減數(shù)分裂相關(guān)的10個基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增�；蚍謩e是vasa, Scp3, Cyclin A1, Dazl, Stra8, miwi, Tnp2, Pgk2, Akap3, Tex18。β-actin基因作為內(nèi)參同時被檢測。對每只小鼠的兩側(cè)睪丸進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用mean±D, p≤0.05表示有顯著差異。 同時,于各組另取5只小鼠,取兩側(cè)睪丸組織,分別提取總蛋白。Western Blot檢測生殖細(xì)胞特異性的vasa, miwi, Scp3蛋白的表達(dá)。β-actin作為內(nèi)參同時被檢測。對兩側(cè)睪丸進(jìn)行比較后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用mean±SD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p≤0.05表示有顯著差異。 結(jié)果 1、無精子癥模型建立：注射35mg/ml白消安5周之后,對睪丸組織進(jìn)行HE切片分析。結(jié)果顯示,曲細(xì)精管的管壁變薄,大量生殖細(xì)胞,包括精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、以及成熟精子都被去除,僅保留少量精原細(xì)胞以及支持細(xì)胞。睪丸顯示為無精子狀態(tài)。 2、HUCMSCs的培養(yǎng)以及鑒定：使用組織塊法對HUCMSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)并傳代。對第三代HUCMSCs進(jìn)行鑒定。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,HUCMSCs能夠表達(dá)CD73, CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物,不表達(dá)CD31造血系細(xì)胞表面標(biāo)志物；G顯帶分析結(jié)果顯示HUCMSCs核型正常；HUCMSCs經(jīng)成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化21天之后,茜素紅和油紅O分別染色均呈現(xiàn)陽性。 3、HUCMSCs移植進(jìn)入無精子癥小鼠模型睪丸：分組注射左側(cè)睪丸后,分籠正常飼養(yǎng)小鼠3周,期間小鼠狀態(tài)良好,沒有出現(xiàn)死亡。 4、移植3周之后,注射了HUCMSCs小鼠的睪丸中,生殖細(xì)胞特異性基因的表達(dá)明顯高于對側(cè)未注射HUCMSCs的睪丸組織；而注射了生理鹽水和HEK293細(xì)胞的睪丸,較對側(cè)相比,生殖細(xì)胞特異性基因的表達(dá)沒有明顯變化。對各組的比較分析結(jié)果顯示,注射了HUCMSCs之后的小鼠睪丸,生殖細(xì)胞特異性基因的表達(dá)水平明顯高于注射了生理鹽水和HEK293細(xì)胞的睪丸組織。在檢測vasa, miwi, Scp3等生殖細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)時,注射了HUCMSCs的睪丸組,明顯高于注射了生理鹽水和HEK293細(xì)胞組。 結(jié)論 1、采用適當(dāng)劑量的化療藥物白消安,在保證動物存活率的情況下,可以成功誘導(dǎo)小鼠無精子癥模型。從而保證了其作為受體進(jìn)行干細(xì)胞的移植實(shí)驗(yàn)。 2、經(jīng)組織塊法原代培養(yǎng)的HUCMSCs,減輕了消化酶對細(xì)胞可能造成的不利影響。采用低代次的HUCMSCs進(jìn)行移植,細(xì)胞幾乎不存在免疫原性。對HUCMSCs細(xì)胞特性的檢測,方法簡便有效。 3、確定HUCMSCs對生殖細(xì)胞特異性基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用。通過與注射生理鹽水和HEK293細(xì)胞的睪丸對照組進(jìn)行比較,說明促進(jìn)作用不是由注射過程或?qū)氘愒醇?xì)胞本身所引起。 4、探索干細(xì)胞治療無精子癥的可能性。并為干細(xì)胞治療成為輔助生殖技術(shù)的補(bǔ)充,應(yīng)用于治療無精子癥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第二部分精子發(fā)生中GRTH蛋白結(jié)合基序與TP2mRNA作用區(qū)域的研究 目的 促性腺激素調(diào)節(jié)睪丸RNA解旋酶(GRTH/DDX25),是一個睪丸特異性的蛋白,屬于RNA解旋酶中的DEAD box家族,高表達(dá)于減數(shù)分裂粗線期、中期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中。這個蛋白受發(fā)育調(diào)節(jié)的控制,并主要在轉(zhuǎn)錄后水平對精子發(fā)生進(jìn)行調(diào)節(jié)。為了理解GRTH t何在轉(zhuǎn)錄后水平對過渡蛋白2(TP2)進(jìn)行調(diào)節(jié),本研究重點(diǎn)闡明GRTH蛋白與生殖細(xì)胞特異性TP2mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的作用區(qū)域。通過鑒定GRTH的RNA結(jié)合基序以及TP2生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合位點(diǎn),明確3'UTR順式作用元件的作用區(qū)域,進(jìn)而深化GRTH在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中對TP2轉(zhuǎn)錄本的調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識。這一研究對于進(jìn)一步理解雄性生殖功能具有重要意義。 方法 1、GRTH全長、截短序列以及TP23'UTR重組質(zhì)粒的構(gòu)建 使用小鼠睪丸組織的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增GRTH全長片段(NM_013932.4)和TP23'UTR區(qū)域片段(TP2, NM_013694, nt408-535)。將GRTH全長片段插入帶有Hind3和Xbal位點(diǎn)的pcDNA3.1(+)載體,構(gòu)建GRTH全長重組質(zhì)粒。根據(jù)GRTH截短片段的設(shè)計(jì),分別進(jìn)行擴(kuò)增并連接到pcDNA3.1(+)載體,標(biāo)記為：pcDNA3.1-483(a.a1-483), pcDNA3.1-G423(a.a1-423), pcDNA3.1-G115-483(a.a116-483), pcDNA3.1-G138(a.a1-138), pcDNA3.1-G166(a.a1-166), pcDNA3.1-G244(a.a1-244), pcDNA3.1-G325(a.a1-325), pcDNA3.1-G388(a.a1-388)。將TP23'UTR片段插入帶有Hind3和EcoRl位點(diǎn)的pST18載體。構(gòu)建TP23'UTR重組質(zhì)粒。 2. GRTH全長(G483)突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建 使用QuickChange mutagenesis kit將G483的第V結(jié)構(gòu)域由ARGID突變?yōu)锳AAID,記為G483Vx將第Ia結(jié)構(gòu)域由PTYELA突變?yōu)镻TSALA,記為G483Iax;隨后使用G483Vx質(zhì)粒為模板,突變其第Ia結(jié)構(gòu)域,記為G483IaxVx。測序驗(yàn)證。 3、體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達(dá)GRTH全長、截短片段蛋白以及Western blot檢測將1μg GRTH全長、截短片段以及突變重組質(zhì)粒,使用TNT兔網(wǎng)織紅細(xì)胞蛋白提取物系統(tǒng),300C孵育90min。Western blot檢測蛋白表達(dá)。 4、生物素末端標(biāo)記TP23'UTR以及分段合成TP23'UTR的RNA 線性化pST18-TP2-3' UTR質(zhì)粒,使用T7RNA polymerase體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成TP23'UTR的RNA；使用T4RNA ligase將RNA與生物素進(jìn)行連接,總共標(biāo)記50pmol的RNA,隨后采用dotting實(shí)驗(yàn)檢測標(biāo)記效率。將127nt長度的TP23'UTR分為3段,每2段之間有10nt的重疊區(qū)間,每段大約50nt,分別標(biāo)記為T1(381/430)、T2(421/470)、T3(461/510)。同時合成生物素標(biāo)記的探針和非標(biāo)記的探針,后者用于競爭性結(jié)合。 5、RNA凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)檢測GRTH各蛋白與TP23'UTR片段的相互作用 每個反應(yīng)都是使用20fmol生物素標(biāo)記的RNA探針與4pmol蛋白共同孵育。安排如下：首先進(jìn)行GRTH全長蛋白(G483)與TP23'UTR RNA的結(jié)合實(shí)驗(yàn)；隨后分別進(jìn)行G483、G115/483.、G423、G388、G325、G244、G166、G138與T1(381/430)、T2(421/470)、T3(461/510)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)；在超泳動實(shí)驗(yàn)中,加入anti-V5抗體,分別檢測G483、G115/483、G423、G388、G325、G244與T1(381/430)、T3(461/510)的相互作用；使用GRTH的突變重組質(zhì)粒G483Iax、G483Vx、G483Iax/Vx的表達(dá)蛋白與T1(381/430)探針進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。所有結(jié)合反應(yīng)均使用Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit進(jìn)行檢測。 結(jié)果 1、RNA-EMSA分析GRTH和127nt TP23'UTR轉(zhuǎn)錄物的相互作用。為了明確GRTH蛋白與TP23'UTR轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的特異性結(jié)合基序,首先根據(jù)RNA解旋酶蛋白的普遍存在的保守基序,設(shè)計(jì)了GRTH截短片段的序列。每一個GRTH截短片段的C端都有V5標(biāo)簽標(biāo)記。Western blot結(jié)果顯示,由體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達(dá)的GRTH的各個截短片段與預(yù)期一致。當(dāng)使用GRTH全長片段(G483)蛋白與TP23'UTR轉(zhuǎn)錄物相互作用時,首先構(gòu)建TP23'UTR的克隆并轉(zhuǎn)錄為RNA,并在其末端標(biāo)記生物素。RNA-EMSA顯示,G483可以和TP23'UTR轉(zhuǎn)錄物相結(jié)合,當(dāng)加入競爭性探針時,能夠阻滯標(biāo)記了生物素的TP23'UTR探針結(jié)合。 2、RNA EMSA分析GRTH截短片段蛋白與TP23'UTR分段探針的結(jié)合。為了進(jìn)一步明確TP23'UTR區(qū)域順式作用元件與GRTH蛋白的相互作用,我們設(shè)計(jì)了3個連續(xù)的、有重疊序列區(qū)間(10nt)的寡核苷酸探針。同時為了系統(tǒng)分析GRTH與TP2轉(zhuǎn)錄物結(jié)合基序的結(jié)合屬性,采用DDX19的晶體結(jié)構(gòu)模型作為參照。結(jié)果所示,G483蛋白可以和T1探針(48nt)形成蛋白-RNA復(fù)合體,T1探針位于緊接TGA終止密碼子的區(qū)域,同時可見GRTH與T3(78-127nt)探針也形成了復(fù)合體。這個結(jié)果同樣出現(xiàn)在G423蛋白與TP23'UTR轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中。G388與TP23'UTR T1探針作用時,實(shí)驗(yàn)中并沒有出現(xiàn)特異性結(jié)合的條帶。G423中包含Motif V,而G388中不含Motif V。說明Motif V在T1與GRTH的結(jié)合中可能起到了關(guān)鍵作用。T2探針不能與GRTH全長以及各截短片段蛋白相互作用,說明介于T1和T3之間的序列區(qū)域不能發(fā)揮順式作用元件的功能與GRTH結(jié)合。 3、G325是缺失了domain II序列的蛋白,domain II包含motifs IV, Vand VⅥ。G325可以和T1探針結(jié)合,有兩條帶出現(xiàn)。而T1在與G244的結(jié)合中,只能檢測到一條帶。在G325和G244結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,兩者都不能和T2、T3結(jié)合。這表明在GRTH的domain I區(qū)域存在另一個RNA結(jié)合位點(diǎn)。G166、G138兩個蛋白都是缺失了Ia結(jié)構(gòu)域序列的蛋白,而Ia結(jié)構(gòu)域在RNA解旋酶中被認(rèn)為是RNA結(jié)合位點(diǎn),實(shí)驗(yàn)證實(shí)G166、G138不能與TP23'UTR轉(zhuǎn)錄物的所有片段結(jié)合。這說明了Ia結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕RTH結(jié)合于RNA轉(zhuǎn)錄物的重要性。 4、G115/483是去掉N端114個氨基酸序列的GRTH蛋白,其與TP23'UTR轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合特征相似于G483：能夠與T1、T3探針結(jié)合。此結(jié)果與G138的結(jié)合特征具有一致性,說明GRTH蛋白N端1146個氨基酸對RNA結(jié)合沒有貢獻(xiàn)。G115/483與T3探針的結(jié)合反而增強(qiáng)。 5、Supershift實(shí)驗(yàn)分析GRTH-TP23'UTR RNA的結(jié)合。在加入anti-V5抗體之后,(G483, G115/483, G423, G325與T1探針結(jié)合的復(fù)合體都出現(xiàn)了超泳動。同樣發(fā)生與T3探針的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中。 6、EMSA分析GRTH突變重組蛋白與TP23'UTR的結(jié)合。GRTH的突變重組質(zhì)粒G483Iax、G483Vx、G483Iax/Vx蛋白與T1(381/430)探針分別作用。結(jié)果顯示,單獨(dú)突變GRTH的一個RNA結(jié)合點(diǎn)時,結(jié)合反應(yīng)仍然發(fā)生,但是當(dāng)同時突變2個RNA結(jié)合位點(diǎn)時,不出現(xiàn)結(jié)合反應(yīng)。說明GRTH在與TP23'UTR的結(jié)合過程中,2個RNA結(jié)合位點(diǎn)很可能是協(xié)同發(fā)揮作用。 結(jié)論 1、證實(shí)了GRTH蛋白的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以和TP23'UTR的RNA相互作用。這一結(jié)果和理論上RNA解旋酶中的Ia結(jié)構(gòu)域、V結(jié)構(gòu)域具有RNA結(jié)合功能相吻合。同時證明2個RNA結(jié)合位點(diǎn)很可能是協(xié)同發(fā)揮作用。 2、研究證實(shí),緊接TP2終止密碼子的3'UTR區(qū)域的50bp序列(T1區(qū)間),相對于其它區(qū)域,對于與GRTH的結(jié)合具有更重要的作用。 3、本研究所證實(shí)GRTH蛋白與TP2RNA形成特異性的RNA結(jié)合復(fù)合體,進(jìn)一步明確了GRTH作為mRNP的組成,參與了TP2RNA信息從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)送。 4、通過對GRTH蛋白中的保守RNA結(jié)合基序的研究,深化了對TP2在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控的理解,進(jìn)一步認(rèn)識了多核糖體位點(diǎn)的相關(guān)組成部分。 5、GRTH (DDX25)蛋白與其同系物DDX19蛋白晶體結(jié)構(gòu)的相似性很高。從而說明了RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Ia和V)結(jié)合并調(diào)節(jié)相關(guān)RNA的普遍性。通過對GRTH在基因表達(dá)調(diào)控中作用的研究,進(jìn)一步認(rèn)識了GRTH在生殖細(xì)胞伸長和完成精子發(fā)生中所起到的重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R698.2

【共引文獻(xiàn)】

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7 及月茹;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)B細(xì)胞增殖和終末分化[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

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9 張嵬;hUC-MSC_S/hHGF基因修飾的hUC-MSC_S移植在心肌損傷修復(fù)中的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

10 董福祿;小鼠體細(xì)胞重編程過程中基因表達(dá)及H2A.Z摻入的變化[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郭偉旭;神經(jīng)生長因子聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠腦損傷研究[D];鄭州大學(xué);2013年

2 暴志國;ADSCs在組織工程化軟組織當(dāng)中的應(yīng)用與研究[D];鄭州大學(xué);2013年

3 于曉云;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對慢性腦缺血大鼠海馬區(qū)Cdc42表達(dá)及認(rèn)知功能的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

4 袁靜;尼羅羅非魚性腺發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及Fox家族生物信息學(xué)分析[D];西南大學(xué);2013年

5 黃聰;凋亡通路與抗氧化通路基因多態(tài)性與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

6 那榮妹;MSCs移植對擴(kuò)張型心肌病TGF-β1、AT_1、CYP11B2及心肌膠原表達(dá)影響的研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2013年

7 武斌;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植在顱腦損傷的作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

8 孫淑娟;大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠黑色素瘤影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

9 李樹裕;小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立與體外誘導(dǎo)向生殖細(xì)胞分化研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

10 王永霞;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成肝樣細(xì)胞的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

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