【摘要】：目的:評估γ分泌酶抑制劑PF-03084014對去勢抵抗性前列腺癌細胞Notch信號通路的抑制作用,觀察癌細胞對多烯紫杉醇化療的敏感性改變,并進一步探索PF-03084014提高多烯紫杉醇化療敏感度的分子機制。方法:(1)體外實驗:利用人前列腺癌細胞系DU145和PC3,多烯紫杉醇抵抗型DU145R和PC3R細胞,分別用DMSO、PF-03084014、多烯紫杉醇、多烯紫杉醇+PF-03084014孵育,測定細胞存活和NICD的表達。(2)體內(nèi)實驗:建立軟組織和骨轉(zhuǎn)移灶前列腺癌小鼠模型,當(dāng)腫瘤體積達到基線后,隨機分為四組,進行以下處理:對照、口服PF-03084014、注射多烯紫杉醇、PF-03084014+多烯紫杉醇聯(lián)合治療。每周兩次評估腫瘤的生長情況。待處理周期結(jié)束后,獲取腫瘤組織。免疫組化定量測定腫瘤組織中Ki67,cleaved-caspase 3和CD31的表達。PCR測定組織中HEY1和HEY2 mRNA的表達。Western blot方法來測定NICD,Cyclin E,BCL-2,BCL-xl,BAK,BAX,MEK1/2,phosphor-MEK1/2(ser217/221),ERK1/2,phosphor-ERK1/2(T202/Y204),AKT,phosphor-AKT(ser473),PI3K,phosphor-PI3K(tyr455/199),EGFR,P52,E-cadherin,Snail,Slug,MDR1,NANOG的表達。流式細胞計數(shù)測定組織細胞中ALDH的表達,無血清培養(yǎng)基下測定組織細胞懸浮成球能力。結(jié)果:(1)體外實驗:PF-03084014抑制前列腺癌DU145,PC3和DU145R,PC3R細胞的生長和NICD的表達,并成濃度和時間依賴性。PF-03084014增強DU145R,PC3R對多烯紫杉醇的敏感度。(2)在多烯紫杉醇敏感型細胞皮下成瘤模型中,單獨使用PF-03084014使DU145腫瘤的生長降低39.7%,PC3腫瘤降低28.9%;多烯紫杉醇處理組中,DU145腫瘤體積縮小36.1%,PC3縮小38.5%;而聯(lián)合用藥組DU145和PC3腫瘤體積分別降低了64.1%和56.6%。而四種不同處理組中小鼠體重并沒有顯著的差異(P=0.5786)。對于耐藥型細胞皮下成瘤模型,單獨使用PF-03084014使DU145R和PC3R分別下降45%和35%。而高濃度的多烯紫杉醇(10mg/kg)使DU145R和PC3R下降36%和18%。兩種藥物的聯(lián)合治療PC3R和DU145R腫瘤體積分別下降了74.4%和56.7%。對于耐藥型細胞骨轉(zhuǎn)移灶模型,多烯紫杉醇的處理并沒有對腫瘤的生長產(chǎn)生抑制作用。而使用PF-03084014后,多烯紫杉醇的處理對耐藥腫瘤重新產(chǎn)生抑制作用。免疫組化結(jié)果顯示,相比于對照組,PF-03084014組中Ki67陽性率減少了19.8%,聯(lián)合用藥組減少了48%;PF-03084014組cleaved-caspase3的表達增加了1.9倍,聯(lián)合用藥組中升高了6.7倍。(3)在DU145皮下腫瘤中,PF-03084014組中Ki67表達相較于對照組下降了42.5%,cleaved-caspase3的表達上升了91%,微血管密度下降了84.4%;聯(lián)合用藥組,三種蛋白的表達的改變率為-68.3%,+290.6%,-88.4%。口服PF-03084014后,DU145和DU145R腫瘤組織中NICD-1蛋白的表達和Notch通路靶基因HEY1和HEY2 mRNA的表達均下降;細胞周期相關(guān)蛋白CyclinE的表達下降;促凋亡蛋白BAK和BAX表達升高,而抗凋亡蛋白BCL-XL和Bcl-2表達下降;DU145細胞中MEK-ERK通路磷酸化水平下降,DU145R細胞中AKTPI3K的磷酸化水平也被抑制;E-cadherin的表達上升,波形蛋白vimentin和EMT轉(zhuǎn)錄因子snail,slug的表達受到抑制;多重耐藥相關(guān)蛋白MDR1的表達下降;表皮生長因子受體EGFR表達下降;NFkB家族蛋白P52的表達也下降。與對照組相比,喂養(yǎng)PF-03084014后,腫瘤組織中高表達ALDH的細胞比例降低,干細胞的轉(zhuǎn)錄因子NANOG的表達也降低。與多烯紫杉醇組相比,聯(lián)合用藥組中的DU145懸浮微球生成率下降,停藥后腫瘤再生長的倍增時間降低。結(jié)論:在軟組織和骨轉(zhuǎn)移灶環(huán)境中,PF-03084014通過抑制Notch通路使CRPC細胞內(nèi)促生長的信號減弱,促凋亡的信號增強,最終抑制去勢抵抗性前列腺癌腫瘤的生長。同時它還通過抑制與耐藥相關(guān)的多種途徑,使多烯紫杉醇耐藥型CRPC細胞再次對多烯紫杉敏感。這為聯(lián)合PF-03084014和多烯紫杉醇的臨床應(yīng)用提供了必要的前期基礎(chǔ),為更有效的治療CRPC提供了新的解決思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25

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本文編號：2370738