【摘要】：引言： 人類組織間充質干細胞(hMSCs, human mesenchymal stem cells)是一類非造血系的基質或間充質祖細胞,它可以自我更新并分化成為多種不同的間質組織,包括骨、脂肪、肌肉以及軟骨,其中從骨髓中提取的hMSCs又叫骨髓基質細胞。近年來由于人們發(fā)現(xiàn)它有和胚胎干細胞類似的多分化潛能,同時在體外實驗中易于提取和擴增,以及它潛在的醫(yī)療和科研價值,已經引起了研究者們廣泛的關注。 在本研究的實驗構思中本研究相信其中前列腺基質細胞在良性前列腺增生和前列腺癌中提供了腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及治愈過程中的生態(tài)位和細胞微環(huán)境。同時基質細胞在局部形成了一個內皮細胞、肌細胞、脂肪細胞、軟骨細胞以及成骨細胞的前體池,該前體池或許包含了最原始的間充質干細胞,即本研究假設出的多潛能基質細胞人前列腺間充質干細胞(hPMSCs, human prostate-derived mesenchymal stem cells)。相對于前列腺上皮干細胞的相關研究本研究對hPMSCs它的生物特性依然比較模糊,甚至hPMSCs這一名稱在內外文獻中尚未見報道。這可能是由于本研究發(fā)現(xiàn)和分離hPMSCs的方法不同,分離后對hPMSCs的處置不同,以及hPMSCs尚無可以作為金標準的特異的細胞分子表面標志物,加之來源于不同病患和不同部位的hPMSCs自身也存在差異,最后還有研究hPMSCs分化潛能的誘導途徑也不一致,導致hPMSCs這一概念由于過于混沌而尚未建立起來。因此目前國內外尚無人在這一領域發(fā)表成果。本研究的實驗對象和目的正是探索和研發(fā)從人良性前列腺增生組織基質分離人類前列腺間充質干細胞的方法,從而鑒定出它們獨有的生物學特性。希望通過本研究使本研究從hMSCs中衍生出“前列腺間充質干細胞hPMSCs"的概念,從而探索出一條研究前列腺腫瘤發(fā)生、診斷和治療的途徑并豐富人組織來源間充質干細胞的概念。 實驗目的： 通過本實驗本研究期待解釋以下科學問題：1)證實人前列腺hPMSCs的存在并鑒定出人前列腺hPMSCs基本生物學特性。2)通過從以下各種分選方式得到的人前列腺間充質單核細胞亞群,貼壁粘附法人前列腺間充質單核細胞亞群,免疫磁珠陽性分選單一抗原CD105, CD133和CD271人前列腺間充質單核細胞亞群各自分別建立起單一純化的人前列腺hPMSCs,同時摸索出其標準的體外培養(yǎng)條件。3)研究和比較各hPMSCs亞群向內胚層成骨細胞以及脂肪細胞和外胚層神經細胞分化的潛能。4)通過實驗證實CD133和CD271單克隆陽性分選的hPMSCs可以作為理想的前列腺疾病研究臨床和科研的種子細胞,表面抗原CD133和CD271也就是分離人前列腺間充質干細胞最有效率的表面標志物。同時為人前列腺來源的hPMSCs的培養(yǎng)和體外干細胞活性的維持提供實驗方法和依據,為研究hPMSCs與前列腺腫瘤的發(fā)生,發(fā)展以及治療奠定基礎。 材料和方法： 本實驗以接受了前列腺電切術后(TURP)病人增生的前列腺組織標本,所有標本的獲取均得到了英國愛丁堡大學醫(yī)學倫理學委員會的認證。 獲取的前列腺組織標本經過Percoll液(d=1.073g/m1)提取出了hPMNCs細胞混懸液之后并培養(yǎng)擴增到第一代之后,hPMNCs被分成了3份(3/5,1/5和1/5),其中的3/5本研究平均的分成了3份,這3份前列腺單核細胞本研究分別用CD105、CD133和CD271單克隆抗體陽性免疫磁珠進行分選,而其余的一個1/5本研究直接用粘附貼壁法分選出了PA前列腺單核細胞亞群,另一個1/5本研究直接將它培養(yǎng)到第三代作為對照細胞株。通過以上的處理本研究分別獲得了5個亞群的細胞,之后本研究將分選出的各細胞亞群接種在T75培養(yǎng)瓶內,給予完全培養(yǎng)基CCM (Complete Culture Medium)培養(yǎng)到第三代(P3)。 為了保持對照實驗結果評估的一致性,本研究將所有五個前列腺間充質干細胞分選亞群(前列腺單核細胞亞群,PA前列腺單核細胞亞群以及單克隆抗體陽性CD105、CD133和CD271陽性亞群)在體外培養(yǎng)到第三代(P3)。通過不同的分選流程得到了可穩(wěn)定傳代的以下五個細胞亞群：貼壁粘附法人前列腺間充質單核細胞亞群,免疫磁珠分選單一抗原CD105,CD133和CD271和人前列腺間充質單核細胞亞群并分別對它們的生物特性進行了系統(tǒng)性的研究,并同時探討了它們在體外向內胚層成骨細胞以及脂肪細胞和外胚層神經細胞分化的潛能(通過比較各亞群茜素紅S和油紅0染色能力以及免疫熒光照相和PCR分析),各部分的實驗方法概要如下： 成纖維細胞樣克隆生成單位計數(shù)(Colony forming units-Fibroblast,CFU-F)：為了測定該五個亞群間充質干細胞形成成纖維樣集落克隆的能力,以上五個細胞亞群均消化后重新種植在成纖維細胞樣克隆生成培養(yǎng)液MACS NH CFU-F Medium (Miltenyi Biotec Co, Germany, order no130-091-676)中9天并被種植在1%凝膠鍍膜過的六孔板內。在第9天六孔板被以蒸餾水漂洗,之后以甲醇固定并且用結晶紫細胞染液進行大體染色同時克隆形成單位被計數(shù)統(tǒng)計(成纖維集落克隆形成單位的能力代表了非造血系干細胞其生長以及分化的能力)。 流式細胞儀檢測(Flow Cytometry,FCM):這四個細胞亞群的膜表面標志物,本研究使用BD公司生產的鼠抗人細胞膜抗體,其中特異性的間充質干細胞抗體包括CD73、CD44、CD105、CD90和CD166以及造血系干細胞膜表面標志物CD14,CD34以及CD45。總的來說本研究將1×105個細胞洗脫下來并在黑暗中在4。C孵育30mins。孵育后的細胞被重新漂洗同時使用Coulter FACS XL-MCL流式細胞儀進行檢測。 成骨分化誘導：為了揭示間充質干細胞成骨分化的能力本研究從以上各亞群的1×105個前列腺間充質干細胞中分別置于德國美天旎生物公司的非造血系成骨分化培養(yǎng)液(Miltenyi Biotec, Germany,order no.130-091-678)的6孔板中。所有這些細胞每3天換液1次并連續(xù)培養(yǎng)四周,本研究從第9天開始可以觀察到為了評價各亞群成骨分化的能力培養(yǎng)板,首先以磷酸鹽緩沖溶液漂洗干凈之后在每孔中滴入4%多聚甲醛兩mins進行固定,最終以蒸餾水洗凈。培養(yǎng)板在茜素紅染液中漂染一mins,最終以乙醇溶液清洗干凈從而獲得生成的磷酸鈣結節(jié)(紅色)并進行美國Dynex公司MRX(?)酶標儀OD值讀取。 成脂分化誘導：為測定以上各的亞群細胞成脂分化潛能,本研究在六孔板中分別放入1×105個洗脫下的細胞,將細胞更換非造血系成脂分化培養(yǎng)液(130-091-677)。所有細胞每周換液兩次并連續(xù)培養(yǎng)四周,之后以油紅將細胞中的脂滴進行染色,洗脫后以美國Dynex公司MRX(?)II酶標儀進行0D值讀取比較其各組成脂分化能力。 神經分化誘導：為了檢測CD271單克隆抗體陽性分選亞群向神經分化的潛能,1×105個細胞被平均的種植于12孔板。同時種植后給予更換成非造血系N2B27培養(yǎng)液(Stem Cell Sciences Co, USA, Catalogue Number:SCS-SF-NB-02)先預培養(yǎng)48小時,以保證細胞對分化培養(yǎng)液的適應。之后本研究在更換的N2B27培養(yǎng)液中加入NGF(神經生長因子,30ng/m1),FGF-b(纖維母細胞生長因子-b,20ng/m1)以及RA(全反式維甲酸,0.5ug/m1)。在培養(yǎng)的48及72小時后將每組中的一個培養(yǎng)板分別進行熒光染色固定從而測它們表達GFAP以及NESTIN的表達,其表達的效率本研究通過熒光染色顯微鏡來觀察。熒光染色處置中,本研究先將培養(yǎng)板以磷酸鹽緩沖溶液清洗,之后使用4%的甲醛溶液中固定5mins,最終以蒸餾水漂洗干凈。染色階段,第一步細胞被固定并且用非特異性蛋白進行阻滯。第2部兩個抗體被分別的加入到之上不同亞群的培養(yǎng)孔中。最終細胞都與熒光標記的第二級抗體共同作用30mins從而將目的基因蛋白在熒光顯微鏡下標識出來。 實驗結果： 在此研究中本研究綜合評價了五個細胞亞群：①未純化的前列腺基質單核細胞hPMNCs。②粘附貼壁法分選得到的hPMSCs。③細胞表面標志物CD105陽性前列腺基質單核細胞CD105-hPMSCs。④細胞表面標志物CD133陽性前列腺基質單核細胞CD133-hPMSCs。⑤細胞表面標志物CD271陽性前列腺基質單核細胞CD271-hPMSCs。通過對以上五個細胞亞群之間以下等項目的比較：(1)細胞生長特性。(2)成纖維細胞樣克隆生成單位(Colony forming units-Fibroblast,CFU-F)的效率比較。(3)對各細胞亞群間充質干細胞相關標志物表達(CD105,CD166, CD34, CD271, CD73, CD105, CD45, CD14)的測定。(4)比較以上五個細胞亞群它們成脂、成骨、成神經體外分化的潛能以及效率。結果羅列如下： 免疫磁珠分選結果：經過本研究的實驗證實了免疫磁珠體外純化人前列腺間充質單核細胞中CD105,CD133和CD271陽性細胞亞群的可行性,本研究取良性前列腺增生患者前列腺電切標本并制備單細胞懸液,采用免疫磁珠分選法分選出CD105,CD133和CD271陽性細胞亞群,并在鏡下使用臺盼藍細胞染色觀察分選前后的細胞活力,并用流式細胞測定純化前后CD105,CD133和CD271的陽性表達率。本研究發(fā)現(xiàn)通過免疫磁珠單克隆抗體分選后所得CD105細胞純度為(97.3±1.86)%,通過免疫磁珠單克隆抗體分選后所得CD133細胞純度為(88.3±3.06)%通過免疫磁珠單克隆抗體分選后所得CD271細胞純度為(89.5±1.8)%。純化前后的間充質細胞活力無統(tǒng)計學差異(P0.05)。因此本研究得出結論,應用CD105,CD133和CD271作為hPMSCs的分子表面標志及德國美天旎生物公司(Miltenyi Biotec Co, Germany)的免疫磁珠分選系統(tǒng)可從人良性前列腺增生患者前列腺電切標本直接分選得到高純度的CD105,CD133和CD271陽性前列腺間充質干細胞,同時該分選系統(tǒng)處理的細胞活力在分選中不受影響。 通過顯微鏡下細胞形態(tài)學觀察：本研究分選出的5個hPMSCs前列腺間充質干細胞亞群均具有人類組織間充質干細胞基本的生物學特性,在顯微鏡下大多數(shù)細胞呈現(xiàn)小梭形,核仁明顯,其中細胞核較大,而且混雜的扁平的細胞極少。本研究在體外給予10%胎牛血清FBS加α-MEM培養(yǎng),在細胞生長到80%融合時傳代,其各亞群細胞在體外傳代35pd,生長狀態(tài)仍然良好。當細胞融合接近100%時呈現(xiàn)旋渦狀或平行排列。本研究取第三代的hPMSCs來繪制細胞生長曲線,經計算其對數(shù)生長期倍增時間約為26±2.3小時。 成纖維細胞樣克隆生成單位結果：本研究將分選出的五個前列腺間充質干細胞亞群分別培養(yǎng)在六孔板內,用德國美天旎生物公司非造血系成纖維細胞樣克隆生成培養(yǎng)液培養(yǎng)9天。結果本研究觀察到免疫磁珠分選得到的CD271和CD133陽性亞群獲得了最多的成纖維細胞樣克隆生成單位(Colony forming units-Fibroblast, CFU-F)數(shù),分別是51±7.31and76±10個集落生成,它們的克隆集落數(shù)與MNC相比多了3倍以上而且CD271和CD133它們的融合速度也遠遠快于其他三個細胞亞群。 流式細胞術結果：本研究分選出的hPMSCs高表達間充質基質細胞表面標志而不表達造血系的表面標志。流式細胞儀檢測體外擴增第3代的細胞,結果顯示它們均不表達CD14,CD45,而高表達CD73,CD90,CD105,CD166,以及表達基質細胞的分子標志CD44,不表達造血干細胞的分子標志CD34,也不表達CD45和CD14。 hPMSCs成骨和成脂分化：本研究取P3代的各亞群hPMSCs細胞在德國美天旎生物公司(Miltenyi Biotec Co,Germany)的成脂和成骨分化液中分別培養(yǎng)28天和9天后觀察其內的脂滴和該結節(jié)形成并且通過油紅0和茜素紅染色后洗脫進行定量比較,本研究發(fā)現(xiàn)結果和它們的增殖能力一致,CD271和CD133亞群的成脂和成骨能力遠高于其他三個亞群。 在本研究的實驗中CD271陽性免疫磁珠分選hPMSCs亞群可在體外誘導分化為外胚層的神經干細胞和神經膠質細胞。體外誘導神經細胞的條件是N2B27培養(yǎng)液中添加3Ong/ml的β-NGF,20ng/ml的FGF-b和0.5ng/ml的RA。在培養(yǎng)48小時后細胞形態(tài)學發(fā)生改變,一些細胞的胞質收縮,細胞體內向外伸出雙極和多極的長突出。在有些細胞中可以觀察到生長錐以及絲突樣的結構,免疫組化熒光結果顯示分化后的細胞表達神經祖細胞特異性的標志物GFAP和Nestin。本研究應用熒光抗原標記的方法通過免疫熒光顯微鏡觀察到GFAP和Nestin熒光染色陽性細胞,同時通過聚合酶鏈式反應PCR(Polymerase Chain Reaction)發(fā)現(xiàn)神經分化細胞表達GFAP和Nestin,以上這些細胞形態(tài)學改變和免疫檢測結果表明本研究培養(yǎng)的hPMSCs同樣可以在合適的條件下分化成為神經膠質細胞和神經元細胞。同時本研究觀察到經過以上誘導出的神經細胞在兩周后仍然有60%以上的存活率。 本研究使用PCR的方法研究在新鮮獲得的CD271陽性免疫磁珠分選亞群成神經分化后表達神經祖細胞早期的特異性標志物(Nestin)和晚期特異性標志物(GFAP)的水平,本研究發(fā)現(xiàn)在CD271陽性亞群中CD271和以上兩個特異性標志物均有表達而且有價值的是這兩個標志物在對照組(未分化組)中均無表達。 總之本研究所獲得的前列腺間充質干細胞在體外誘導條件具有向內胚層成骨細胞以及脂肪細胞和外胚層神經細胞分化的潛能。 綜合實驗的結果證實本研究培養(yǎng)的前列腺間充質細胞可以被稱為前列腺間充質干細胞(hPMSCs)。1)在液氮凍存12個月后復蘇測試,凍存的HphMSCs生長狀態(tài)良好,鏡下是均一的小梭形CFU-F顯示克隆形成能力仍然很高。2)它們高表達間充質干細胞的各細胞表面分化抗原,而且不表達造血系干細胞的細胞表面分化抗原。3)它們在體外誘導條件可以向內胚層成骨細胞以及脂肪細胞和外胚層神經細胞分化的潛能(通過比較各亞群茜素紅S和油紅0染色的能力)。由于以上三項均符合本研究對于人組織間充質干細胞的要求,所以本研究認為本研究得到的前列腺基質提取細胞可以被稱為前列腺間充質干細胞(hPMSCs). 統(tǒng)計學處理：所有細胞增殖的數(shù)據,細胞克隆形成單位,以及相關抗體陽性表達率,0D值讀數(shù)本研究均通過均數(shù)加減標準差x±s進行納入。各細胞亞群之間的不同本研究進行學生T檢驗,多組均數(shù)間比較進行單因素方差分析,其中方差不齊數(shù)據進行非參數(shù)檢測。所有的統(tǒng)計學分析結果應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析(芝加哥,美國)。P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。 結論和討論： 本研究第一次綜合利用了hPMSCs的密度離心法獲得了前列腺間充質單核細胞hPMNCs,利用貼壁生長特點獲得了貼壁粘附法人前列腺間充質單核細胞亞群PA-hPMSCs,用改進了的免疫磁珠分選法建立了單一純化的人前列腺間充質干細胞hPMSCs細胞系,免疫磁珠分選CD105,CD133以及CD271單克隆陽性細胞亞群,這五個細胞亞群在體外可以長期穩(wěn)定增殖并保持分化潛能。本研究的實驗結果第次證實了在人前列腺中同樣存在人類組織間充質干細胞,它的生長特性類似骨髓干細胞和胎盤干細胞。而且本研究得到的前列腺hPMSCs在經過多次傳代或者長期凍存后依然可以維持他旺盛的生長并依然可以分化成神經細胞、成骨細胞和脂肪細胞。 至今最常用最經典的是Friedenste.A.J.(1970)和Gronthos.S.(2003)等研究者在體外培養(yǎng)的一些貼壁粘附法分離出的基質細胞可以有克隆集落樣生長即可以獲得成纖維細胞樣克隆生成單位(Colony forming units-Fibroblast, CFU-F),通過進一步研究他們發(fā)現(xiàn)這樣獲得的細胞是混雜細胞系,其中只有一部分從克隆株團中針挑出的培養(yǎng)細胞可以有間充質干細胞楊的多分化潛能,即PA-hPMSCs.就像其他提純法獲得的間充質干細胞,通過粘附貼壁法只可以從人組織中分理出比較混雜的包含間充質干細胞的多個細胞系,通過對這一經典方法獲取的細胞和其他分選方式得到的細胞亞群的對比試驗本研究期待了解它的基本生物特征。 在本研究我們一一比較了對不同分選機制下得到的五個hMSCs亞群不同的增殖活性和分化潛能,本研究的數(shù)據揭示了應用不同的分選機制得到的前列腺hMSCs表達不同的生長能力、分化潛能以及不同水平的分化抗原表達,通過陽性分選機制得到的CD271和CD133亞群它們的克隆形成能力是其他亞群的三倍,而且它們的增殖速度也遠遠快于其他三個亞群,這一可能的機制是因為這兩個細胞亞群中細胞的異質性最低,細胞譜系比較單一,這一建議干細胞的活性也許有可能會被其他混雜細胞所抑制。同時低密度種植對于間充質干細胞的增殖很有好處揭示也許細胞過早的融合會導致接觸抑制。但在培養(yǎng)過程中本研究發(fā)現(xiàn)與初始P0代提純的CD271單克隆抗體陽性分選亞群和CD133單克隆抗體陽性分選亞群,它們中CD271和CD133的表達在傳到第三代的時候將會大量丟失。可能的解釋是CD271和CD133陽性分選細胞可以通過分化出CD271和CD133陰性細胞得以保存自身的干細胞活性。 通過本研究在體外長期培養(yǎng)獲得的數(shù)據本研究發(fā)現(xiàn)CD271單克隆抗體陽性分選亞群和CD133單克隆抗體陽性分選亞群包含有最少的造血系細胞混雜,通過CD45的流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)其表達最低的陽性率(分別為1.66%和2.17%)。而CD105相對HPMNC和PA-hPMSCs有中間水平的CD45表達(4.39%),也許這種CD45的低表達可以解釋CD271單克隆抗體陽性分選亞群和CD133單克隆抗體陽性分選亞群在本研究中最高的增殖活性和分化潛能。 綜合以上兩點因此本研究認為作為人前列腺間充質干細胞理想的分離和鑒定表面標志物是應該能最大程度的代表那些極少存在于基質中的同時又基本上不表達造血系細胞表面標志物的那些多潛能干細胞,本研究的研究結果表明通過免疫磁珠單克隆富選下的CD271和CD133表達陽性亞群是所有目前已知選項中擁有最強自我增殖能力和分化能力的前列腺間充質干細胞亞群。 作為前列腺間充質干細胞研究的前沿對干細胞分選和培育的金標準的建立迫在眉睫,本研究的研究展示了對于人前列腺間充質干細胞從人的陽性前列腺增生良性術后標本這一免疫磁珠為基礎的目的基因標志分選方法是可行的,本研究的數(shù)據顯示CD271即低親和力神經生長因子受體(Low affinity nerve growthfactor receptor,LNGFR)以及CD133可以作為可行的分選標志物來富集人前列腺間充質干細胞。在最后本研究所使用的這項方法亦可完全被復制到分選前列腺癌間充質干細胞中去。本研究同樣顯示了通過CD133和CD271單克隆陽性分選的hPMSCs可以作為理想的前列腺疾病研究臨床和科研的種子細胞,并為人前列腺hPMSCs的培養(yǎng)和體外干細胞活性的維持提供了實驗方法和依據,為研究hPMSCs與腫瘤研究奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2;R697.3

【參考文獻】

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3 黃艷;樊瑜波;;力學因素影響骨髓間充質干細胞活性的研究進展[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2010年04期

4 Robert C Zhao;;Immunosuppressive properties of cloned bone marrow mesenchymal stem cells[J];Cell Research;2007年03期

5 楊靖;王慶海;曾秋棠;毛曉波;;人骨髓間充質干細胞對同種異體調節(jié)性T細胞的影響及可能機制實驗研究[J];中國實驗血液學雜志;2007年04期

6 劉全華;葛健;劉開彥;;CD271和CD133果真能用于臍血間充質干細胞陽性分選嗎?[J];中國實驗血液學雜志;2010年05期

7 宋陸茜;郭娟;賀琪;許峰;楊蓮萍;李曉;常春康;;骨髓增生異常綜合征患者骨髓間充質干細胞細胞遺傳學異常的研究[J];中國實驗血液學雜志;2011年02期

8 Maya Fakhry;René Buchet;David Magne;Eva Hamade;Bassam Badran;;Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts[J];World Journal of Stem Cells;2013年04期

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本文編號：2334695