【摘要】：以腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)為代表的腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,由于其對放化療及生物免疫治療缺乏敏感,故成為腎癌術后復發(fā)、轉移等晚期病人預后差的關鍵因素。深入研究腎透明細胞癌的發(fā)病機理,并探尋合適的標靶是當前該病診斷、治療及預后的潛在方向。在腎透明細胞癌中,SETD2基因是僅次于VHL和PBRM1的第三大抑癌基因,而有關它的表達缺失或下調機制,目前尚不明晰。微小RNA (miRNA)是一類短鏈非編碼RNA,通過在轉錄后水平負性調控靶基因,下調靶基因表達并影響其所在的信號通路傳導,從而在生物體生命活動尤其是腫瘤發(fā)生、進展中扮演重要角色。結合生物信息學及相關的預測軟件,我們發(fā)現miRNA與SETD2存在潛在的關聯性,即SETD2基因的表達缺失或下調可能源于某一或某些miRNAs的負性調控。因此,本研究旨在從miRNA介導的轉錄后調控方面著手探索SETD2表達缺失或下調的機制,以闡明SETD2及相關miRNAs對ccRCC細胞生物學行為的影響,為未來的臨床診治提供理論依據。我們將通過檢測SETD2基因及各預測候選miRNAs在人ccRCC中的表達水平,揭示它們在ccRCC臨床診斷與治療中的潛在意義；通過體外實驗,探索并驗證ccRCC中靶向調控SETD2的miRNAs;研究miRNA調控SETD2對ccRCC細胞生物學行為的影響,并探索其潛在的作用機制。本研究分為以下三個部分： 第一部分SETD2基因及各預測miRNAs在人腎透明細胞癌中的表達研究 目的：檢測人正常腎組織與腎透明細胞癌(ccRCC)組織及細胞中SETD2基因、各預測miRNAs的表達差異,篩選與SETD2潛在關聯的miRNA(s)。 方法：采用實時定量PCR(qPCR)和western blot法分別檢測40例臨床組織標本及細胞系中SETD2基因的mRNA水平和蛋白表達量,并分析其表達差異。隨機選取30例配對ccRCC組織與正常腎組織,采用免疫組織化學染色法(IHC)檢測并分析SETD2蛋白在正常腎與癌組織中的表達差異。應用Target-Scan microRNA.org、miRWalk等多個靶點預測軟件逆向篩選可能靶向作用于SETD2基因的miRNAs,同時結合在線ccRCC的miRNA表達譜數據庫,篩選出可能調控SETD2的]miRNAs。采用qPCR檢測各預測miRNAs在細胞系及組織標本中的表達水平并比較其差異,同時分析各預測miRNAs與SETD2表達的相關性。 結果：相較正常腎組織,SETD2基因的mRNA在77.50%(31/40)的ccRCC組織中顯著下調,而SETD2蛋白表達水平在65.00%(26/40)的ccRCC組織中顯著下調。相較HK-2細胞系,786-0和SN12-PM6細胞中的SETD2基因mRNA和蛋白表達均顯著下調。免疫組織化學染色分析結果顯示SETD2蛋白在正常腎組織中76.67%(23/30)呈強陽性表達,13.33%(4/30)呈弱陽性表達,10.00%(3/30)為低表達；在ccRCC組織中,80.00%(24/30)呈低表達或無表達,16.67%(5/30)呈弱陽性表達,3.33%(1/30)為強陽性表達。miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142-5p和miR-20a-5p被篩選作為可能調控SETD2基因的候選miRNAs。相較HK-2細胞系,miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p和miR-142-5p在786-0和SN12-PM6細胞系中均高表達,而miR-20a-5p表達差異不明顯。相較正常腎組織,miR-23b-5p. miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142-5p和miR-20a-5p在ccRCC中顯著上調的比例分別為：60.00%(24/40)、55.00%(22/40)、67.50%(27/40)、47.50%(19/40)和35.00%(14/40)。經t檢驗分析顯示在ccRCC組織與正常腎組織中表達有顯著差異的miRNAs分別是：miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p和miR-142-5p。進一步通過相關性分析發(fā)現在ccRCC組織中SETD2的mRNA水平與miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p表達水平呈顯著負相關。 結論：在ccRCC中,SETD2基因是一個重要的抑癌基因,其表達缺失或下調可能與候選miRNAs:miR-23b-5p、miR-34b-3p和miR-106b-5p的異常上調有關。 第二部分在腎透明細胞癌中miR-106b-5p靶向調控SETD2及其機制研究 目的：在miRNA介導的轉錄后調控水平探索SETD2基因在腎透明細胞癌中表達缺失或下調的機制。 方法：采用化學合成法獲得各預測miRNAs的抑制劑anti-miRNAs及模擬物mimics,分別將其轉入ccRCC細胞系786-0和SN12-PM6,應用實時熒光定量PCR及western blot法檢測SETD2基因mRNA和蛋白的表達變化。構建含SETD2基因3'-UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報告載體,采用雙熒光素酶法進行檢測分析以探索候選miRNAs對SETD2的調控方式。設計“逆轉”實驗,將小干擾RNA si-SETD2與候選miRNA的抑制劑共轉入腎癌細胞系,應用qPCR和western blot法分別檢測SETD2基因mRNA和蛋白水平的表達變化,進一步探索候選miRNA對SETD2基因可能的調控作用。結果：轉入各預測miRNAs的抑制劑后,僅anti-miR-106b-5p使786-0和SN12-PM6細胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表達顯著上調。而反過來,向786-0和SN12-PM6細胞系中轉入miR-106b-5p的模擬物mimic后,SETD2基因的mRNA和蛋白表達進一步下調。雙熒光素酶檢測分析結果顯示在轉入miR-106b-5p的模擬物mimic后,HK-2、786-0和SN12-PM6細胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性明顯降低,而3’-UTR突變型無顯著影響。相反,在轉入miR-106b-5p的抑制劑后,786-O和SN12-PM6細胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性顯著提高,而3’-UTR突變型無明顯改變。另外,在“逆轉”實驗中,轉入anti-miR-106b-5p可使786-0和SN12-PM6細胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表達顯著上調,而同時轉入si-SETD2將逆轉anti-miR-106b-5p轉入所致的SETD2表達上調作用。 結論：SETD2基因是miR-106b-5p的一個新的靶基因,在腎透明細胞癌中SETD2基因的表達缺失或下調可能是由于miR-106b-5p的過表達所致。 第三部分miR-106b-5p調控SETD2對腎透明細胞癌細胞生物學行為的影響及其機制研究 目的：研究miR-106b-5p調控SETD2對腎透明細胞癌細胞生物學行為的潛在影響,并探索其作用機制。 方法：同前述“逆轉”實驗,將轉染分為5組,即anti-NC+si-NC、anti-miR-106b-5p+si-NC、si-NC、si-SETD2和anti-miR-106b-5p+si-SETD2,分別轉染腎癌細胞系786-O與SN12-PM6,應用流式細胞術檢測各轉染組細胞周期和凋亡的可能變化,并采用EdU法檢測細胞增殖的改變。同時,我們采用qPCR與western blot法分別檢測上述各組轉染情況下腎癌細胞中p53、caspase3的表達變化。同時提取各轉染組細胞的核蛋白,western blot法檢測核蛋白H3K36me3可能的表達變化。另外,通過雙熒光素酶實驗檢測miR-106b-5p調控si-SETD2對p53啟動子活性可能的影響,并應用ChIP技術探索p53基因啟動子與H3K36me3的潛在關系。 結果：流式細胞周期、凋亡檢測及EdU細胞增殖實驗檢測結果顯示在786-0與SN12-PM6中,沉默miR-106b-5p均可使兩種腎癌細胞的細胞周期阻滯在G0/G1期,即G0/G1比例增加,而S期減少,且細胞增殖明顯減少,細胞凋亡明顯增加,而干擾SETD2表達則促進細胞周期的進展,即G0/G1期減少,S期增多,且細胞增殖明顯增加,細胞凋亡明顯減少。此外,干擾SETD2的表達可逆轉沉默miR-106b-5p所致的細胞周期阻滯、凋亡增加和增殖抑制效應。qPCR結果顯示在786-0與SN12-PM6細胞中,沉默miR-106b-5p可使p53基因mRNA明顯上調,而干擾SETD2表達一方面使p53mRNA明顯下調,另一方面還可逆轉沉默miR-106b-5p所致的p53基因mRNA上調效應。各轉染組caspase-3基因的mRNA變化無明顯改變。Western blot結果顯示在沉默miR-106b-5p后,786-0與SN12-PM6細胞中p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase-3蛋白(cleaved caspase-3)的表達顯著增加,而前體caspase-3蛋白(procaspase-3)明顯下調；相較對照組,干擾SETD2表達可使p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase3蛋白(cleaved caspase-3)表達下調,而前體caspase3蛋白(procaspase-3)增加；此外,干擾SETD2可逆轉沉默miR-106b-5p所致的p53、H3K36me3、cleaved caspase-3三種蛋白上調及procaspase-3蛋白下調。ChIP實驗與雙熒光素酶實驗結果顯示在786-O與SN12-PM6中,沉默miR-106b-5p可使H3K36me3與p53啟動子區(qū)的相對結合量顯著增加,p53啟動子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性也明顯增加；而干擾SETD2表達則使H3K36me3與p53啟動子區(qū)的相對結合量顯著減少,p53啟動子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性亦明顯減少；此外,干擾SETD2也逆轉了沉默miR-106b-5p所致的H3K36me3與p53啟動子區(qū)相對結合量增加,及p53啟動子螢火蟲／海腎熒光素酶活性增加的效應。 結論：miR-106b-5p對腎透明細胞癌細胞的周期、凋亡及增殖的影響依賴于其對SETD2的直接靶向調控,"miR-106b-5p—SETD2—H3K36me3—p53/caspase-3"軸可能參與腎透明細胞癌細胞生物學行為的調控。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11

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1 向威;miR-106b-5p靶向調控SETD2基因對腎透明細胞癌細胞生物學行為的影響及機制研究[D];華中科技大學;2015年

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本文編號：2334072