【摘要】：慢性腎臟疾病(CKD)在中國普通人群患病率高達11.8%-13.0%,與之相應,我國每年新增腎臟替代治療患者人數(shù)不斷攀升,如何延緩CKD患者腎功能進展成為亟需解決的難題。近年研究證明脂質異常是公認的促進CKD持續(xù)進展的獨立危險因素。隨著高脂血癥發(fā)生率的增加,脂質對腎臟的不良影響,特別是對合并CKD患者腎毒性日益受到重視。深入研究脂質腎臟損傷的分子機制不僅可以加深對脂質腎毒性的理論認識,也有助于獲得防治和延緩CKD持續(xù)進展的新思路。1982年,Moorhead提出“脂質腎毒性”假說:腎小球病變所引起的高脂血癥和蛋白尿會導致腎臟疾病持續(xù)的進展,而且脂質的異常會同時造成動脈粥樣硬化和腎小球硬化的形成,腎小球硬化和動脈粥樣硬化是一系列相互存在聯(lián)系的臨床疾病中的一部分。我們的實驗通過體外培養(yǎng)的小鼠腎小球足細胞首次發(fā)現(xiàn),小鼠足細胞表達 ROCK1,ox-LDL(oxidized low-density lipoprotein)刺激能調節(jié)足細胞上ROCK1的活性并使裂孔膜蛋白nephrin的表達下降。這個結果表明腎小球足細胞也許通過提高ROCK1的活性來參與脂質腎臟損傷。但有關ox-LDL介導足細胞損傷的具體調控機制,尚未得到深入的研究。Rho激酶(ROCK)是RhoA下游最為重要的效應分子之一,它是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶,有ROCK1和ROCK2兩個異構體,可以被GTP結合蛋白RhoA激活(與GTP結合時被激活,與GDP結合時失活),激活的ROCK可以使其底物如肌球蛋白輕鏈、LIM激酶、埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白、肌球蛋白磷酸化亞單位(MYPT)等磷酸化,在細胞收縮、中性粒細胞遷徙、神經細胞生長發(fā)育和細胞凋亡過程中發(fā)揮極為重要的作用。有實驗表明通過抑制ROCK的表達可以增加自噬小體的體積,進而促進自噬的發(fā)生。另外有研究顯示在體外使用ROCK抑制劑Y-27632可以顯著增加細胞蛋白分解、減少異常蛋白質的積聚,也可以激活細胞內的其他蛋白酶如泛素蛋白酶系統(tǒng),增加自吞噬作用,促進細胞的異常增多的物質的消化和分解。綜上所述,本研究是通過在體外實驗建立ox-LDL誘導的足細胞脂質損傷模型,來觀察ox-LDL對小鼠足細胞ROCK1活性及nephrin表達的影響;并且通過使用ROCK1 siRNA和wt ROCK1質粒來雙向調節(jié)ROCK1來探討ROCK1對足細胞攝取脂質、足細胞膽固醇含量的影響以及nephrin、LC3-Ⅱ、P62、p-ULK1(Ser757)表達的關系,初步來探討ROCK1參與脂質腎臟損傷的發(fā)病機制。研究方法一、小鼠的足細胞培養(yǎng)、鑒定以及處理分組(一)小鼠的足細胞培養(yǎng)方法永生化條件下的足細胞(MPC)復蘇后,使用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基和20-100 U/mL重組的小鼠γ干擾素在5%C02,在33℃條件下誘導增殖和傳代。后續(xù)轉入5%CO2,37℃培養(yǎng)箱分化等待成熟。(二)小鼠足細胞形態(tài)學的觀察以及鑒定將33℃的培養(yǎng)箱和37℃的培養(yǎng)箱中的足細胞在倒置相差顯微鏡下拍片,并觀察比較兩者之間的形態(tài)學差異;采用足細胞特異性骨架蛋白synaptopodin免疫染色來確定足細胞是否已經分化成熟了,成熟的足細胞表達并且延著細胞骨架清晰分布。(三)成熟足細胞的處理分組(1)Ox-LDL刺激對足細胞ROCK1活性影響(2)調控ROCK1的表達對p-MYPT/MYPT、nephrin等表達、足細胞攝取脂質，細胞膽固醇濃度的影響檢測內容使用酶法檢測足細胞膽固醇含量；Western Blot檢測p-MYPT/MYPT、Nephrin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ等的蛋白表達水平；使用免疫熒光的方法來檢測足細胞中脂質的變化情況。四、統(tǒng)計學分析計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x=±SD)表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。多組間結果比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。結果與正常對照組相比，ox-LDL刺激上調足細胞ROCK活性增加(p-MYPT表達升高)，同時伴有nephrin、LC3-Ⅱ表達下降(p0.05)，，P62、p-ULK1表達上升(P均0.05)，細胞內膽固醇含量增加(p0.05);抑制ROCK1表達能抑制ox-LDL誘導的p-MYPT水平上調，同時上調nephrin、LC3-Ⅱ的表達(p0.05),下調P62、p-ULK1的表達(p均0.05),降低細胞內膽固醇含量(p0.05);與之相反,增加ROCK1表達能進一步增加ox-LDL誘導的p-MYPT水平,并進一步降低nephrin、LC3-Ⅱ的表達,增加P62、p-ULK1的表達(p均0.05)和細胞內膽固醇含量(p0.05)。結論ROCK1介導的脂質自噬障礙是ox-LDL誘導足細胞損傷的重要途徑。
[Abstract]:Chronic kidney disease (CKD) has a high prevalence of 11. 8% to 13. 0% in the Chinese general population. In recent years, it has been shown that lipid abnormality is an independent risk factor for promoting the continuous development of CKD. With the increase of the incidence of hyperlipidemia, the adverse effects of the lipid on the kidney, especially the renal toxicity of patients with CKD, are becoming more and more important. In-depth study of the molecular mechanism of lipid kidney injury can not only deepen the theoretical understanding of the toxicity of lipid and kidney, but also help to obtain a new thought to prevent and delay the continuous development of CKD. In 1982, Moorhead proposed the 鈥渓ipoid nephrotoxicity鈥

本文編號：2317904