【摘要】：研究背景及目的前列腺癌作為威脅男性健康最常見腫瘤之一,其發(fā)病率在發(fā)達國家高居男性腫瘤首位,占全部惡性腫瘤的28%,死亡率僅次于肺癌。2008年全世界范圍內(nèi)前列腺癌新發(fā)病例約899000例,死亡病例約258000例,其中72%的新發(fā)病例和53%的死亡病例均發(fā)生于歐洲、北美等發(fā)達國家。在世界范圍內(nèi)亞洲地區(qū)的前列腺癌發(fā)病率是最低的,但是近年來也有明顯上升趨勢。中國前列腺癌的發(fā)病率與死亡率雖遠低于歐美發(fā)達國家,但近年來隨著人口老齡化、環(huán)境污染和生活條件的改善,發(fā)病率呈迅速上升趨勢,早已成為影響男性健康的主要因素。不斷上升的發(fā)病率使前列腺癌的研究越來越受到關(guān)注重視。1941年,Huggins等首次闡述了通過切除睪丸去除雄激素能夠抑制前列腺的生長,并且能夠在轉(zhuǎn)移前列腺癌患者身上產(chǎn)生戲劇化的主觀和客觀的效果。這一發(fā)現(xiàn)為前列腺癌的治療揭開了新篇章,也是對激素依賴性癌癥治療的重大突破。從此內(nèi)分泌治療在前列腺癌治療中占據(jù)經(jīng)久不衰的重要地位。隨著去雄激素治療這一概念的提出,在20世紀50年代有許多雌激素治療前列腺癌的報道。然而,內(nèi)分泌治療平均1.5年-2年的時間,幾乎所有的患者的病變都會逐漸進展為激素非依賴性前列腺癌或者激素難治性前列腺癌,將不能再憑借激素來治療。而對于激素非依賴性前列腺癌,當前還沒有標準且有效的治療方案,最后導致病情惡化,治療失敗。到現(xiàn)在為止,前列腺癌發(fā)生雄激素非依賴性改變的機制還沒有完全清楚。近些年來,不論在基礎(chǔ)還是在臨床研究中,對于前列腺癌的治療方法的研究成為一個活躍的領(lǐng)域。腫瘤是一類多基因疾病,細胞基因組完整性的改變是腫瘤發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。細胞周期的監(jiān)控機制是細胞基因組完整性的重要保證,如果監(jiān)控機制發(fā)生破壞,則導致細胞遺傳的不穩(wěn)定性,染色體發(fā)生重排,如基因缺失、擴增和及移位等,當突變基因的累積破壞了細胞周期的驅(qū)動機制,將導致細胞發(fā)生失控性生長,最后導致癌變。細胞分裂周期的調(diào)控是一個復雜的生物學過程,這一過程涉及到幾乎全部的癌基因、抑癌基因的生物學效應(yīng)。許多癌基因、抑癌基因直接參與細胞周期的調(diào)控,或者本身就是細胞周期調(diào)控復合體的主要成分。這些基因變異的結(jié)果,造成了細胞周期的失控,失去控制的細胞將無限制增殖,形成的克隆群體便是腫瘤。因此,有學者指出腫瘤是一類細胞周期疾病。慢病毒載體(lentiviral vector,LV)作為一類來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體,以其轉(zhuǎn)染效率高,可感染分裂期和非分裂期細胞,可容納較大的基因片段等優(yōu)點,在科研領(lǐng)域有著良好的發(fā)展前景。RNA干擾(RNA interference,RNAi)其機制是通過抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來抑制基因表達。將與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA導人細胞中,雙鏈RNA先降解為小干擾RNA(Small interfering RNA,即siRNA),隨后siRNA與一些蛋白合成RNA誘導沉默復合體(RNA—inducedsilencing complex,RISC),引發(fā)靶mRNA降解而導致基因表達沉默。將慢病毒載體作為RNAi技術(shù)的載體,可以結(jié)合兩者優(yōu)勢特異性抑制哺乳動物的各類細胞中基因的表達,成為基因功能研究和基因治療的有力手段。因此近年來RNAi技術(shù)和慢病毒載體技術(shù)的發(fā)展已為前列腺癌治療的研究提供了一種新思路。腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的過程,在多因素(包括環(huán)境因素和遺傳因素)作用下,導致原癌基因的激活和抑癌基因功能的喪失.在腫瘤細胞的惡性進展過程中,隨著基因突變的積累,導致其逃避正常的細胞分裂調(diào)控機制、細胞凋亡能力下降、向周圍組織入侵和遠處轉(zhuǎn)移的能力增加。調(diào)節(jié)細胞周期進行、凋亡及轉(zhuǎn)移的機制非常復雜,已知有大量蛋白質(zhì)分子參與了這些過程。最近,韓趙東等應(yīng)用雙向電泳及質(zhì)譜分析的方法鑒定出2566種腫瘤蛋白,并通過生物信息學分析出有60個差異性蛋白在前列腺癌中,其中表達為上調(diào)的有37個,而表達為下調(diào)的則有23個。而其中有14種基因及其蛋白產(chǎn)物(ACLY,CAPG,GSTM3,GSTP1,HNRNPL,IMPDH2,KRT15,MCCC2,MSN,MYL9,PYGB,SERPINB5,TRAP1 and VCL)在前列腺癌中表達具有明顯的差異。在真核生物細胞中,由基因組DNA通過轉(zhuǎn)錄直接生成的RNA由于其隨機分布在核內(nèi),且長短不一,故被稱作核內(nèi)不均一性RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。在hnRNA經(jīng)加工成為成熟mRNA的過程中,需要很多蛋白質(zhì)的參與。根據(jù)結(jié)合的RNA種類的不同,這些蛋白可以分作3類:核小核糖核蛋白(snRNP),mRNA蛋白(mRNP)和核內(nèi)不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclearribonucleoprotein,hnRNP)。研究發(fā)現(xiàn),hnRNP家族中的各成員在DNA損傷修復、轉(zhuǎn)錄、hnRNA剪接mRNA輸送、降解等生物過程中發(fā)揮著重要作用。核不均一蛋白L(HnRNPL)是由Pinol-Roma S等在早期轉(zhuǎn)錄片段中意外發(fā)現(xiàn)的核糖核蛋白,這種蛋白富含胱氨酸及脯氨酸,是核不均一核糖核蛋白(核蛋白)復合體的一個重要組成部分。已知在肺癌中存在,并與肺癌的發(fā)生發(fā)展有著緊密的關(guān)系,同時我們前期的研究已經(jīng)證實了HnRNP L與生精細胞的增值和凋亡關(guān)系密切。hnRNPs家族中的HnRNPK已被報道和前列腺癌有著緊密的關(guān)系,并參與前列腺癌的增值、分化以及凋亡過程。我們前期用組織芯片(81點前列腺增生組織及99點前列腺癌組織)進行免疫組化,結(jié)果顯示,HnRNP L蛋白在前列腺癌中高表達,與文獻報道的結(jié)果相一致。因此,本課題的設(shè)計思路:用HnRNP L慢病毒感染前列腺癌細胞,建立穩(wěn)定低表達HnRNP L蛋白的前列腺癌細胞株;在此基礎(chǔ)上,探導HnRNP L蛋白可能參與的前列腺癌細胞信號通路;并且進行HnRNPL對PC3細胞的生長調(diào)控機制的在體研究,揭示HnRNP L參與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制,同時為前列腺癌的治療提供新的靶點。方法:1、慢病毒轉(zhuǎn)染PC3細胞并且用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效果實驗分為第一組(陰性對照組:PC3細胞+慢病毒陰性對照),第二組(干擾組:PC3細胞+HnRNP L慢病毒),慢病毒轉(zhuǎn)染PC3細胞72小時后在熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)、生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率;并且用Western Blot檢測HnRNP L蛋白在兩組中的表達,檢測轉(zhuǎn)染效果。2、慢病毒沉默 HnRNPL 基因?qū)?PC3 細胞 Bcl-2、caspase-3、caspase-9、iNOS、CEACAM1基因表達的影響用Western Blot和RT-PCR檢測陰性對照組和干擾組中Bcl-2、caspase-3、caspase-9、iNOS、CEACAM1 表達的變化。3、HnRNPL對PC3細胞的生長調(diào)控機制的在體研究用陰性對照組和干擾組細胞分別注射到5只裸鼠皮下,構(gòu)建前列腺癌裸鼠移植瘤,定期觀察裸鼠生長情況及裸鼠皮下腫瘤形成情況,裸鼠飼養(yǎng)至4周時處死,取下腫瘤,制作石蠟切片并進行HE染色,顯微鏡下觀察腫瘤的病理結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1、慢病毒轉(zhuǎn)染PC3細胞72小時后熒光顯微鏡白光下觀察成上皮細胞形態(tài),生長狀態(tài)良好。在激發(fā)光下,部分PC3細胞能發(fā)出綠色熒光,熒光較均勻的分布于整個細胞,慢病毒的轉(zhuǎn)染效率較高。Western blot結(jié)果顯示,干擾組PC3細胞的HnRNP L蛋白被成功下調(diào),我們成功建立了穩(wěn)定低表達HnRNPL蛋白的前列腺癌細胞,為后續(xù)的實驗打下堅實的細胞基礎(chǔ)。2、Western blot結(jié)果顯示,PC3細胞中下調(diào)HnRNPL后,Bcl-2表達量沒有明顯的差異,而激活型caspase-3和激活型caspase-9的表達量升高;RT-PCR結(jié)果顯示,在下調(diào)HnRNP L后,PC3細胞Bcl-2mRNA表達量無明顯變化(t=0.063,P=0.956),但是 iNOSmRNA 的表達量顯著下調(diào)(t=27.152,P=0.001),CEACAM1mRNA 的表達量也顯著下降(t=127.891,P=0.000)。3、干擾組和陰性對照組裸鼠分別皮下注射干擾組和陰性對照組PC3細胞,4周后,陰性對照組裸鼠均長出腫瘤,將陰性對照組裸鼠處死,取出移植瘤,而干擾組裸鼠4周內(nèi)均未長出腫瘤。陰性對照組腫瘤HE染色顯示:腫瘤細胞呈無規(guī)則分布,細胞體積明顯增大,典型的核大漿少且核大小不一,較多病理性核分裂現(xiàn)象,無明顯腺體結(jié)構(gòu)存在。結(jié)論:1、我們用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功建立了穩(wěn)定、高效、均一的低表達HnRNP L蛋白的前列腺癌細胞,為后續(xù)的實驗打下基礎(chǔ)。2、在PC3細胞中下調(diào)HnRNP L的表達后,可促進細胞的凋亡,其凋亡增加可能是與 caspase-3、caspase-9、iNOS 及 CEACAM1 通路有關(guān)3、下調(diào)HnRNPL蛋白的表達可能會有抑制前列腺癌腫瘤形成的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

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本文編號：2261755