【摘要】：目的;腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性疾病之一,其中腎透明細胞癌是最主要的病理類型。以往研究表明VHL/HIF通路和rniRNA在腎透明細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,而本課題旨在探尋這兩條經(jīng)典通路之間的關聯(lián)及其在腎透明細胞癌中的作用和機制。方法：1.通過VHL外顯子測序和VHL啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)分析檢測182例腎透明細胞癌組織中基因組DNA的VHL狀態(tài),并選取8例VHL野生型腎透明細胞癌組織與8例VHL缺陷型腎透明細胞癌組織配對,通過微陣列分析兩組之間miRNA的表達差異,并通過實時定量PCR進行驗證;通過實時定量PCR和Western blot檢測miRNA轉錄后生成過程中的關鍵酶Dicer、Drosha、Exportin-5和DGCR8在36例VHL野生型腎透明細胞癌組織和36例VHL缺陷型腎透明細胞癌組織中的表達情況,并通過實時定量PCR檢測相應癌旁腎組織的Dicer表達情況;通過在腎透明細胞癌細胞系中分別過表達或敲低VHL后檢測Dicer的表達情況。2.通過線性回歸分析檢測腎透明細胞癌組織中Dicer和HIF mRNA表達水平的相關性,并通過在腎透明細胞癌細胞系中過表達和敲低Dicer后檢測HIF及其下游基因的表達情況;基于微陣列數(shù)據(jù)和實時定量PCR的結果,通過生物信息學軟件的分析找出與HIF-2a有潛在結合位點的由Dicer介導的miRNA,并通過實時定量PCR、Western blot和熒光素酶實驗驗證該miRNA能否直接靶向作用于HIF-2α。3.通過克隆形成實驗、血管形成實驗和裸鼠體內(nèi)成瘤實驗探討Dicer在VHL缺陷型腎透明細胞癌中的生物學功能以及是否通過HIF-2α發(fā)揮作用;對146例VHL缺陷型腎透明細胞癌患者進行隨訪,通過Kaplan-Meier法和COX回歸模型分析Dicer mRNA表達水平高低和臨床預后的關系。結果：1.微陣列數(shù)據(jù)分析和實時定量PCR結果顯示VHL缺陷型較VHL野生型腎透明細胞癌組織中的總體miRNA表達是下調(diào)的,而下調(diào)miRNA的前體表達卻是上升的;miRNA轉錄后生成過程中的關鍵酶只有Dicer在VHL缺陷型中的表達較VHL野生型中的表達明顯下降,同時Dicer的表達水平在VHL缺陷型腎透明細胞癌組織中較癌旁組織明顯下調(diào),而Dicer在VHL野生型腎透明細胞癌組織和相應癌旁組織中的表達水平卻無明顯差異;在腎透明細胞癌細胞系中VHL可以正向調(diào)控Dicer的表達水平。2.線性回歸分析結果顯示Dicer與HIF-2a的mRNA表達水平成負相關,與HIF-1a的mRNA表達水平無相關性;在VHL缺陷型腎透明細胞癌細胞系中Dicer可以反向調(diào)控HIF-2a及其下游基因的表達,同時HIF-2a是由Dicer介導的niR-182-5p的直接靶點。3.克隆形成實驗和血管形成實驗證實了Dicer能在體外抑制VHL缺陷型腎透明細胞癌的增殖和血管生成,裸鼠成瘤實驗證實了Dicer也能在體內(nèi)抑制VHL缺陷型腎透明細胞癌的生長,而且Dicer的這一抑癌功能在某種程度上是通過下調(diào)HIF-2a實現(xiàn)的;Kaplan-Meier生存分析顯示在VHL缺陷型腎透明細胞癌患者中,Dicer mRNA低表達水平組的術后生存率較Dicer mRNA高表達水平組更差,COX回歸分析顯示Dicer mRNA低表達水平是術后生存率較低的一個獨立危險因素。結論：腎透明細胞癌中Dicer被VHL正向調(diào)控并能通過下調(diào)HIF-2a及其下游基因的表達來抑制VHL缺陷型腎透明細胞癌的腫瘤表型;Dicer的低表達是VHL缺陷型腎透明細胞癌患者臨床預后差的獨立危險因素。因此,Dicer在未來有可能成為腎透明細胞癌風險分級的腫瘤標志物和新的治療靶點,為腎透明細胞癌的診斷和治療提供新的思路。
[Abstract]:Objective: Renal cell carcinoma (RCC) is one of the most common malignant diseases in the urinary system, and renal clear cell carcinoma (RCCC) is the most important pathological type.Previous studies have shown that the VHL/HIF pathway and rniRNA play an important role in the development of RCC. Methods: 1. The VHL status of genomic DNA in 182 cases of renal clear cell carcinoma was detected by VHL exon sequencing and VHL promoter region methylation analysis, and 8 cases of VHL wild type renal clear cell carcinoma and 8 cases of VHL deficient renal clear cell carcinoma were selected to pair with each other. Differential expression of iRNA was detected by real-time quantitative PCR and Western blot, and the expression of key enzymes Dicer, Drosha, Exportin-5 and DGCR8 in 36 VHL wild renal clear cell carcinoma tissues and 36 VHL deficient renal clear cell carcinoma tissues was detected by real-time quantitative PCR and Western blot. PCR was used to detect the expression of Dicer in the adjacent renal tissues. The expression of Dicer was detected by overexpressing or knocking down VHL in renal clear cell carcinoma cell lines. Dicer-mediated microRNAs with potential binding sites to HIF-2a were identified by bioinformatics software analysis based on microarray data and real-time quantitative PCR results. Real-time quantitative PCR, Western blot and luciferase assay were used to verify the direct targeting of the microRNAs. To investigate the biological function of Dicer in VHL-deficient renal clear cell carcinoma and whether it plays a role through HIF-2alpha through clone formation test, angiogenesis test and tumor formation test in nude mice; to follow up 146 patients with VHL-deficient renal clear cell carcinoma and analyze Dice by Kaplan-Meier method and COX regression model. Results: 1. Microarray data analysis and real-time quantitative PCR showed that the expression of total microRNAs in VHL deficient renal clear cell carcinoma was down-regulated compared with that in VHL wild type renal clear cell carcinoma, but the expression of precursors of down-regulated microRNAs was up-regulated. Dicer was the only key enzyme in the post-transcriptional production of microRNAs. The expression level of Dicer in VHL-deficient renal clear cell carcinoma was significantly lower than that in VHL-deficient renal clear cell carcinoma, but the expression level of Dicer in VHL-deficient renal clear cell carcinoma and its adjacent tissues was not significantly different. Linear regression analysis showed that Dicer was negatively correlated with the mRNA expression of HIF-2a, but not with the mRNA expression of HIF-1a; Dicer could reverse the expression of HIF-2a and its downstream genes in VHL-deficient renal clear cell carcinoma cell lines, and HIF-2a was Dicer-mediated niR-18. Direct target of 2-5p. 3. Cloning and angiogenesis assays confirmed that Dicer could inhibit the proliferation and angiogenesis of VHL-deficient clear cell renal cell carcinoma in vitro. Tumor formation assay in nude mice confirmed that Dicer could also inhibit the growth of VHL-deficient clear cell renal cell carcinoma in vivo, and Dicer's anti-tumor function to a certain extent is universal. Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival rate of patients with VHL-deficient renal clear cell carcinoma was worse in the group with low expression of Dicer mRNA than in the group with high expression of Dicer mRNA. COX regression analysis showed that low expression of Dicer mRNA was an independent risk factor for lower survival rate. Dicer is positively regulated by VHL and can inhibit the tumor phenotype of VHL-deficient renal clear cell carcinoma by down-regulating the expression of HIV-2a and its downstream genes. Low expression of Dicer is an independent risk factor for poor clinical prognosis in patients with VHL-deficient renal clear cell carcinoma. Grade I tumor markers and new therapeutic targets provide new ideas for the diagnosis and treatment of renal clear cell carcinoma.
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11

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本文編號：2198011