本文選題：Fyn + 高糖��； 參考：《山東大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一,臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性發(fā)展的蛋白尿,最終可導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease, ESRD)。足細(xì)胞,即腎小球臟層上皮細(xì)胞,被覆于腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)上,是腎臟濾過屏障的重要組成部分。糖尿病腎病時(shí)腎小球的病理改變除了基底膜增厚和系膜基質(zhì)的增生外,足細(xì)胞的數(shù)量和相關(guān)結(jié)構(gòu)功能的病變?cè)谔悄虿∧I病的發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要作用,足細(xì)胞的損傷被認(rèn)為是糖尿病腎病的一種早期病變。Fyn是Src家族酪氨酸激酶(Srcfamily tyrosine kinase, SFKs)的成員之一,可被多種刺激信號(hào)激活,調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路,在細(xì)胞生長、粘附和運(yùn)動(dòng)性等方面發(fā)揮作用。既往研究證實(shí),在足細(xì)胞中Fyn可與CD2AP以及synaptopodin相互作用,并且可以直接結(jié)合并磷酸化裂孔膜蛋白nephrin,介導(dǎo)足細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。但對(duì)于Fyn信號(hào)途徑是否參與介導(dǎo)了糖尿病腎病時(shí)的足細(xì)胞損傷及蛋白尿的發(fā)生,目前尚未有研究報(bào)道。本研究旨在探討Fyn在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的作用,為糖尿病腎病的臨床干預(yù)和治療提供新的靶點(diǎn)。 方法： 1.足細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：永生化小鼠足細(xì)胞系由美國哈佛醫(yī)學(xué)院Peter Mundel教授惠贈(zèng)。培養(yǎng)瓶采用I型膠原包被,在33℃條件下,以含有10%胎牛血清及10U/ml重組小鼠γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5到7天使足細(xì)胞增殖,在37℃條件下,以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)10到14天使足細(xì)胞分化成熟。足細(xì)胞分化成熟后隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組,高糖組,高滲組,Fyn siRNA組和Control siRNA組。 2.足細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的檢測：應(yīng)用real-time PCR及western b1ot分別從mRNA和蛋白水平檢測各組足細(xì)胞nephrin、synaptopodin、desmin和vimentin的表達(dá)變化。 3.Fyn表達(dá)水平及Fyn活性的檢測：應(yīng)用小鼠足細(xì)胞特異性的Fyn siRNA干擾足細(xì)胞Fyn的表達(dá),采用real-time PCR及western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測各組Fyn的表達(dá),采用免疫沉淀及western blot檢測各組足細(xì)胞中Fyn的活化情況(磷酸化Fyn-Tyr418). 結(jié)果： 1.高糖可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞出現(xiàn)損傷性改變。高糖組以含有30mM葡萄糖的高糖培養(yǎng)基刺激足細(xì)胞48小時(shí),與正常對(duì)照組相比較,足細(xì)胞nephrin和synaptopodin的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P0.05); desmin和vimentin的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P0.05)。 2.高糖刺激使足細(xì)胞Fyn的活化增加。與正常對(duì)照組相比較,高糖組足細(xì)胞Fyn的活性位點(diǎn)Tyr418磷酸化水平升高(P0.05),提示Fyn的蛋白激酶活性增強(qiáng),而足細(xì)胞總Fyn的表達(dá)水平無明顯變化(P0.05)。 3.干擾Fyn的表達(dá)可減輕由高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。應(yīng)用特異性Fyn siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后再給予高糖刺激48小時(shí),足細(xì)胞內(nèi)nephrin和synaptopodin蛋白以及mRNA表達(dá)水平均較高糖組升高(P0.05),而desmin及vimentin蛋白以及mRNA的表達(dá)水平較高糖組降低(P0.05)。 結(jié)論：Fyn參與介導(dǎo)了高糖所誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷,通過干擾Fyn的表達(dá)可改善這一損傷。
[Abstract]:Purpose :

Diabetic nephropathy ( DN ) is one of the complications of diabetic microvascular complications . The clinical manifestations are the progressive development of proteinuria , which can lead to end - stage renal disease . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is an early lesion in diabetic nephropathy . Fyn is a member of the family tyrosine kinase ( Srcfamily tyrosine kinase , SFKs ) .

Method :

1 . Culture and grouping of foot cells : The mouse full - term cell lines were donated by Professor Peter Mundel , Harvard Medical School in the United States . The culture flasks were cultured in RPMI 1640 medium containing 10 % fetal bovine serum and 10 U / ml recombinant mouse gamma - interferon at 33 鈩，

本文編號(hào)：2031250