本文選題：β-甘油磷酸 + 血管平滑肌肌細(xì)胞�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 高磷是慢性腎臟�。╟hronic kidney disease，CKD）患者血管中膜鈣化的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可引起心血管事件等嚴(yán)重并發(fā)癥，其誘導(dǎo)鈣化的機(jī)制可能是通過血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）膜上的Ⅲ型鈉磷轉(zhuǎn)運(yùn)體（Pit-1）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起VSMCs表型轉(zhuǎn)化而發(fā)生鈣化。進(jìn)一步研究顯示鎂離子既可以抑制Pit-1通道活性而減少磷向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，又可以競爭性地拮抗細(xì)胞內(nèi)的磷，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的磷水平的調(diào)節(jié)起一定的作用，但鎂離子與血管平滑肌細(xì)胞鈣化的關(guān)系目前尚不清楚。本研究旨在通過高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化模型來探討鎂離子和VSMCs鈣化兩者之間的關(guān)系，以明確鎂離子在VSMCs鈣化中的作用。 方法： 1VSMCs原代培養(yǎng) 運(yùn)用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)獲取VSMCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞鑒定，并繪制正常平滑肌細(xì)胞生長曲線。 2實(shí)驗(yàn)分組及處理 VSMCs隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、高磷組及鎂干預(yù)組，陰性對(duì)照組采用低糖DMEM含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基，高磷組在正常培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10mmol/L β-甘油磷酸制成高磷培養(yǎng)基，鎂干預(yù)組在上述高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入氯化鎂，使鎂離子的終濃度分別為1mmol/L（鎂干預(yù)組1）、2mmol/L（鎂干預(yù)組2）和3mmol/L（鎂干預(yù)組3），共刺激7d。 3不同濃度鎂離子對(duì)VSMCs鈣化的影響 VSMCs鈣化檢測分別用茜素紅（Alizarin red stain）鈣化染色和比色法測定細(xì)胞內(nèi)鈣含量的方法。 4不同濃度鎂離子對(duì)鈣化的VSMCs堿性磷酸酶（ALP）活性的影響 取3～5代細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度約為2×105/孔，干預(yù)時(shí)間為7d，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2～3次，每孔加入500μL0.1％TritonX-100置4℃環(huán)境中約12～24h，然后反復(fù)吹打裂解細(xì)胞后置于離心管中離心，按化學(xué)發(fā)光法檢測ALP活性。 5不同濃度鎂離子對(duì)鈣化的VSMCs Cbfα1mRNA表達(dá)的影響 運(yùn)用RT-PCR方法研究不同濃度鎂離子對(duì)VSMCs中Cbfα1mRNA水平表達(dá)的影響。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間均數(shù)兩兩比較用SNK檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls），以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1VSMCs原代培養(yǎng) 采用組織塊貼壁法獲取原代大鼠VSMCs，通常情況下貼壁的動(dòng)脈組織塊約3～4d后可爬出少許細(xì)胞，以長梭形為主，排列較分散，隨著時(shí)間延長細(xì)胞數(shù)目顯著增多，約6～7d細(xì)胞可鋪滿大部分瓶底。當(dāng)細(xì)胞數(shù)目占瓶底面積的80～90%時(shí)可傳代，傳代后細(xì)胞起初為圓形或橢圓形，貼壁后可逐漸伸展為梭形，胞漿豐富，，核呈圓形或卵圓形，多個(gè)細(xì)胞交錯(cuò)重疊生長，呈典型的“峰-谷”樣。用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測平滑肌細(xì)胞特異性的抗體—α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體（α-SMA actin），其陽性結(jié)果為細(xì)胞胞漿強(qiáng)表達(dá)，呈棕黃色的免疫反應(yīng)產(chǎn)物。 2不同濃度鎂離子對(duì)VSMCs鈣化的影響 運(yùn)用茜素紅鈣化染色對(duì)VSMCs染色結(jié)果示：各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，VSMCs鈣化染色均不同程度地加重，而鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大鈣化結(jié)節(jié)染色程度逐漸降低，當(dāng)鎂離子濃度為2mmol/L開始出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)縮小，呈濃度依賴性，3mmol/L時(shí)鈣化結(jié)節(jié)顯著降低，達(dá)最小狀態(tài)。 運(yùn)用比色法測定VSMCs內(nèi)鈣含量結(jié)果示：與陰性對(duì)照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組刺激VSMCs后，鈣含量均顯著增加，鎂干預(yù)組與高磷組相比，鈣含量隨著鎂離子的變化而變化，其結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，即鎂離子濃度越大，鈣含量越低，并當(dāng)鎂離子濃度為2mmol/L開始鈣含量明顯降低，當(dāng)鎂離子濃度達(dá)3mmol/L時(shí)，鈣含量檢測結(jié)果也相應(yīng)達(dá)最小值，且各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3不同濃度鎂離子對(duì)鈣化的VSMCs ALP活性的影響 鎂離子刺激VSMCs后不同組間ALP結(jié)果示：與陰性對(duì)照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組VSMCsALP水平均不同程度地增加。鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大，ALP活性的變化趨勢與鈣含量結(jié)果相似，亦呈濃度依賴性，3mmol/L時(shí)ALP活性達(dá)最小值。 4不同濃度鎂離子對(duì)鈣化的VSMCs Cbfα1mRNA表達(dá)的影響 不同濃度鎂離子刺激VSMCs后不同組間Cbfα1mRNA的表達(dá)結(jié)果示：與陰性對(duì)照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組的VSMCs Cbfα1mRNA水平均不同程度地增加，而鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大，Cbfα1mRNA水平也相應(yīng)發(fā)生變化，變化趨勢與鎂離子濃度相關(guān)，呈濃度依賴性，當(dāng)鎂離子濃度為3mmol/L時(shí)mRNA水平降至最低，不同組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1鎂離子可抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，且呈濃度依賴性。 2鎂離子抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生鈣化的機(jī)制可能是通過抑制VSMCs轉(zhuǎn)分化作用來實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:Objective:
High phosphorus is an independent risk factor for the calcification of the vascular membrane in chronic kidney disease (CKD) patients, which can cause serious complications such as cardiovascular events. The mechanism for inducing calcification may be by entering cells through the type III sodium and phosphorus transporter (Pit-1) on the membrane of vascular smooth muscle cells (VSMC), causing the transformation of the VSMCs phenotype. Further studies have shown that magnesium ions can inhibit the activity of Pit-1 channels and reduce phosphorus transfer to cells, and can antagonize the phosphorus in cells in a competitive manner, and play a role in the regulation of phosphorus levels in cells. However, the relationship between magnesium ion and vascular smooth muscle cell calcification is not clear. This study aims to induce high phosphorus induction. The VSMCs calcification model was used to investigate the relationship between magnesium ions and VSMCs calcification, so as to clarify the role of magnesium ions in VSMCs calcification.
Method錛

本文編號(hào)：1959105