本文選題：脂肪干細(xì)胞 + 神經(jīng)細(xì)胞　； 參考：《武漢大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及多向誘導(dǎo)分化的研究目的：據(jù)報(bào)道脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells, ADSCs)具有多向分化能力并在特定的誘導(dǎo)劑下能夠向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,這可能為神經(jīng)性勃起功能障礙(Erectile dysfunction,ED)的修復(fù)提供新的治療思路。本文旨在探討脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的潛能,為恢復(fù)陰莖海綿體神經(jīng)(Carvernous nerve,CN)受損導(dǎo)致勃起功能障礙的研究建立基礎(chǔ)。方法：從SD雄性大鼠腹股溝和附睪頭端取出脂肪組織,剪碎后用I型膠原酶37℃水浴消化、離心,加培養(yǎng)基重懸后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞表面CD分子,第3代脂肪干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)劑下誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。用兩種方法進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)：方法一是加入誘前誘導(dǎo)劑表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)誘導(dǎo)3天后加入神經(jīng)誘導(dǎo)劑吲哚美辛、 胰島素、3.異丁基.1.甲基黃嘌呤(IBMX)方法二與方法一的區(qū)別是沒(méi)有加入誘前誘導(dǎo)劑BDNF。然后用油紅0染色來(lái)鑒定誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞,用免疫熒光法及Western Blot檢測(cè)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的膠原纖維酸性蛋白(Glialfibrillary acidic protein,GFAP)和p-微管蛋白(β-tubulinⅢ,Tuj-1).結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞表面CD分子的結(jié)果為：CD44(+)細(xì)胞率為96.0%、CD90(+)細(xì)胞率為98.5%、CD45(一)細(xì)胞率為0.6%、CD34(一)細(xì)胞率為0.5%。脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞,油紅O染色脂滴染成紅色。脂肪干細(xì)胞在神經(jīng)誘導(dǎo)劑下誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞,48h后熒光染色GFAP、β-tubulin Ⅲ蛋白表達(dá)陽(yáng)性,方法一和方法二的誘導(dǎo)率分別為74±3.3.3%、65+2.1%和51±1.2%、41±1.1%。且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05)。結(jié)論：我們成功從脂肪組織中分離提取并體外培養(yǎng)得到脂肪干細(xì)胞。研究表明脂干細(xì)胞在體外能夠分化成神經(jīng)細(xì)胞,并在方法一作用下向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)率高,時(shí)間短；在誘前誘導(dǎo)液中加入BDNF為體外神經(jīng)誘導(dǎo)提供一個(gè)新的誘導(dǎo)方法從而能獲得更多的神經(jīng)細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞可能成為治療神經(jīng)性勃起功能障礙的理想干細(xì)胞。第二部分脂肪干細(xì)胞對(duì)大鼠陰莖海綿體神經(jīng)再生修復(fù)作用的研究目的：據(jù)報(bào)道保留海綿體神經(jīng)的前列腺癌根治術(shù)是處于性活躍時(shí)期的局限性前列腺癌患者治療的選擇。在接受手術(shù)或者前列腺放療的前列腺癌患者,術(shù)后頻繁的發(fā)生勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)。在大多數(shù)情況下,海綿體神經(jīng)(cavernous nervers, CNs)可能在保留神經(jīng)的前列腺切除時(shí)由于手術(shù)操作原因不經(jīng)意受損。另外有研究顯示脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠促進(jìn)CN的再生修復(fù)。本研究通過(guò)大鼠海綿體內(nèi)注射ADSCs探討ADSCs是否對(duì)CN的再生有促進(jìn)調(diào)節(jié)作用,以及評(píng)估雙側(cè)CN受損導(dǎo)致ED的恢復(fù)情況。方法：將30只SD雄性大鼠隨機(jī)分成3組(每組10只)：一組僅分離雙側(cè)CN作為假手術(shù)組,其余兩組行雙側(cè)CN鉗夾損傷。鉗夾損傷組中一組在損傷后立即海綿體內(nèi)注射ADSCs,另外一組(損傷對(duì)照組)在損傷后不作治療。3個(gè)月后通過(guò)電刺激CN測(cè)海綿體內(nèi)壓來(lái)評(píng)估勃起功能。測(cè)壓后取雙側(cè)鉗夾損傷CN行甲苯胺藍(lán)染色；取大鼠陰莖中段組織一部分行Masson染色。一部分行WesternBlot檢測(cè)陰莖組織nNOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果：術(shù)后3個(gè)月測(cè)壓結(jié)果顯示損傷對(duì)照組最大海綿體內(nèi)壓(maximal intracavernous pressure,maxICP)為38.6±12.4,最大海綿體內(nèi)壓與平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)比值為0.26±0.03,顯著低于假手術(shù)組(maxICP為108.2±10.8, ICP/MAP比值為0.68±0.08),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)ADSCs治療組1naxICP (90.1±12.8)和ICP/MAP(0.44±0.05)顯著高于對(duì)照組(P0.05)。CN甲苯胺藍(lán)染色顯示ADSCs治療組神經(jīng)軸突數(shù)為(92.5±18),損傷對(duì)照組神經(jīng)軸突數(shù)為(584±20),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Masson染色結(jié)果顯不ADSCs治療組平滑肌占膠原纖維比例(9.2±2.8)顯著高于對(duì)照組(5.4±1.1,p0.05)。結(jié)論：這些結(jié)果顯示海綿體內(nèi)注射ADSCs能夠促進(jìn)海綿體神經(jīng)再生和勃起功能的恢復(fù)。我們的結(jié)果表明陰莖內(nèi)注射ADSCs夠促進(jìn)神經(jīng)性ED動(dòng)物模型勃起功能的恢復(fù)。第三部分脂肪干細(xì)胞結(jié)合自體靜脈移植修復(fù)大鼠勃起功能障礙的研究目的：海綿體神經(jīng)(cavernous nervers, CNs)損傷是前列腺癌根治術(shù)后發(fā)生勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)的主要原因,這種勃起功能的恢復(fù)仍具有挑戰(zhàn)性。我們主要是探討脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)結(jié)合自體靜脈移植提高雙側(cè)CN較長(zhǎng)切斷損傷大鼠模型勃起功能的可能性。方法：SD大鼠(36只)隨機(jī)分成四組(每組各9只)。A：假手術(shù)組；B：ADSCs結(jié)合自體靜脈移植治療組；C：生理鹽水結(jié)合白體靜脈移植治療組；D：雙側(cè)CN離斷損傷組。3個(gè)月后行海綿體內(nèi)壓(ICP)和平均動(dòng)脈壓(MAP)測(cè)定。測(cè)壓后取大鼠陰莖中段組織一部分行Masson染色,一部分行免疫組化檢測(cè)陰莖組織中nNOS陽(yáng)性纖維。自體移植的靜脈在顯微鏡下進(jìn)行解剖。結(jié)果：術(shù)后3個(gè)月測(cè)壓結(jié)果顯示脂肪干細(xì)胞結(jié)合自體靜脈移植治療組大鼠勃.起功能的恢復(fù)程度(maxICP 78.8±12.7)顯著高于生理鹽水結(jié)合自體靜脈移植治療組(maxICP 48.6±15.7)和雙側(cè)CN離斷損傷組(maxICP 26.5±5.8) (p＜0.05).免疫組化結(jié)果顯示脂肪干細(xì)胞結(jié)合自體靜脈移植治療組大鼠陰莖背側(cè)nNOS陽(yáng)性纖維顯著多于雙側(cè)CN離斷損傷組(p0.05)。Masson染色結(jié)果顯示脂肪干細(xì)胞結(jié)合自體靜脈移植治療對(duì)大鼠陰莖海綿體內(nèi)平滑肌占膠原纖維的比例有保護(hù)作用。ADSCs治療組大鼠陰莖組織中平滑肌占膠原纖維比例(8.5±2.1)顯著高于雙側(cè)CN離斷損傷組(4.6±1.2,p0.05)。脂肪干細(xì)胞結(jié)合自體靜脈移植治療組的移植靜脈在顯微鏡下找到新生的神經(jīng)。結(jié)論：ADSCs結(jié)合自體靜脈移植能夠促進(jìn)大鼠較長(zhǎng)缺損海綿體神經(jīng)(0.8cm)再生和修復(fù),并在一定程度上能夠恢復(fù)大鼠的自主勃起功能。
[Abstract]:The purpose of this study was to investigate the potential of Adipose derived stem cells ( ADSCs ) to differentiate into adipocytes and to induce differentiation into neuron - like cells . Results : The results of flow cytometry showed that CD44 ( + ) cell rate was 96.0 % , CD90 ( + ) cell rate was 98.5 % , CD90 ( + ) cell rate was 98.5 % , CD34 ( I ) cell rate was 0.5 % . Adipose stem cells were induced into adipocytes and oil red O - stained lipid droplets were positive . The induction rates were 74 鹵 3.3 % , 65 + 2.1 % and 51 鹵 1.2 % , 41 鹵 1.1 % , respectively , and the difference of positive cells was statistically significant ( p < 0.05 ) . Conclusion : We successfully isolated from adipose tissue and cultured in vitro to obtain adipose - derived stem cells .
It is suggested that BDNF is an ideal stem cell for the treatment of neurological erectile dysfunction . The second part of adipose - derived stem cells is the ideal stem cell for the treatment of neurological erectile dysfunction . Methods : Thirty SD male rats were randomly divided into 3 groups ( 10 rats in each group ) : 30 SD male rats were randomly divided into 3 groups ( 10 rats in each group ) .
Results : The results showed that the maximal intracavernous pressure ( maxICP ) was 38 . 6 鹵 12 . 4 , and the mean arterial pressure ( MAP ) ratio was 0 . 26 鹵 0 . 03 , which was significantly lower than that of the control group ( P 0 . 05 ) . Conclusion : These results showed that ADSCs were injected into cavernous body to promote the restoration of erectile dysfunction in rats . The results showed that ADSCs were used to promote the recovery of erectile dysfunction in the model of erectile dysfunction after radical prostatectomy . The third part of adipose - derived stem cells combined with autologous vein graft to repair erectile dysfunction in rats .
B : ADSCs combined with autologous vein graft treatment group ;
C : Normal saline was combined with the white body vein graft treatment group .
The results showed that fat stem cells combined with autologous vein graft in the treatment group were significantly higher than those in normal saline group ( maxICP 48.6 鹵 15.7 ) and bilateral CN group ( maxICP 26.5 鹵 5.8 ) ( p < 0.05 ) . Conclusion : ADSCs can promote the regeneration and repair of long - defect cavernous nerves ( 0.8cm ) in rats and restore the function of spontaneous erections in rats to some extent .

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R698

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本文編號(hào)：1837813