本文選題：fancd2os　切入點：精子發(fā)生　出處：《山西醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：研究目的:在課題組前期研究的基礎上,利用實時定量PCR(Real-time PCR)和蛋白印跡技術(Western blotting)從mRNA和蛋白水平分析fancd2os基因在睪丸組織不同細胞系中的表達譜;通過免疫組織化學和免疫熒光染色分析FANCD2OS蛋白在睪丸組織中的細胞定位;并進一步建立過表達fancd2os基因的HEK293T細胞模型,從細胞水平深入探討fancd2os基因的潛在功能。研究方法:1.通過實時定量PCR分析fancd2os mRNA在精原細胞(GC1-spg)、精母細胞(GC2-spd)、睪丸Leydig間質細胞(TM3)、睪丸Sertoli支持細胞(TM4)四種細胞系中的表達;2.運用Western blotting方法檢測FANCD2OS蛋白在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四種細胞系的表達;3.利用免疫組織化學和免疫熒光染色分析FANCD2OS蛋白在睪丸組織中的細胞定位;4.建立fancd2os基因過表達的HEK293T細胞模型,分別利用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及Western blotting檢測fancd2os基因的過表達情況;5.采用CCK8方法檢測過表達fancd2os基因對HEK293T細胞增殖能力的影響;6.利用Western blotting檢測過表達fancd2os基因后HEK293T細胞Caspase3蛋白的水平;7.運用Caspase3熒光染色試劑盒對紫外誘導后HEK293T細胞凋亡狀況進行分析;8.運用流式細胞術檢測過表達fancd2os基因對紫外誘導HEK293T細胞凋亡、線粒體膜電位水平的影響。研究結果:1.實時定量PCR結果顯示fancd2os mRNA在四種細胞系中均有表達,但是在TM3中的表達水平相對較高;2.Western blotting結果顯示FANCD2OS蛋白在四種細胞中都有表達,在TM3中的表達水平相對較高;3.免疫組織化學和免疫熒光染色均發(fā)現(xiàn)FANCD2OS蛋白主要定位在睪丸間質細胞中;4.RT-PCR和Western blotting分析顯示在HEK293T細胞模型中檢測到fancd2os基因的過表達;5.CCK8結果表明轉染重組質粒的HEK293T細胞增殖能力明顯高于空載體組和裸細胞組(p0.05);6.Western blotting結果顯示過表達組活化型Caspase3含量明顯高于其余兩組;7.熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)轉染組的Caspase3熒光陽性信號明顯多于空載體組和對照組;8.流式細胞術分析表明過表達組的細胞凋亡程度明顯高于空載體組和裸細胞組(p0.01),線粒體膜電位下降的百分比明顯高于空載體組和裸細胞組(p0.05)。研究結論:1.fancd2os基因在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四種細胞系中均有表達,但在TM3中的相對表達水平較高;2.fancd2os基因過表達可以抑制HEK293T細胞的增殖能力,降低線粒體膜電位,使細胞內激活型Caspase3蛋白水平增高,對細胞凋亡具有促進作用。
[Abstract]:Objective: to analyze the expression profiles of fancd2os gene in different cell lines of testicular tissue from mRNA and protein level using real-time quantitative PCR(Real-time PCR and Western blotting.The localization of FANCD2OS protein in testicular tissue was analyzed by immunohistochemistry and immunofluorescence staining, and the HEK293T cell model of overexpression of fancd2os gene was established to explore the potential function of fancd2os gene from the cellular level.Research method: 1.The expression of fancd2os mRNA was analyzed by real-time quantitative PCR in four kinds of cell lines: spermatogonia GC1-spg, spermatocyte GC2-spdg, testicular Leydig stromal cell TM-3, testicular Sertoli Sertoli cell line TM4).Western blotting method was used to detect the expression of FANCD2OS protein in four cell lines of GC1-spgC2-spdf3 and TM4.Immunohistochemistry and immunofluorescence staining were used to analyze the cellular localization of FANCD2OS protein in testis.A HEK293T cell model of overexpression of fancd2os gene was established. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting were used to detect the overexpression of fancd2os gene.The effect of overexpression of fancd2os gene on the proliferation of HEK293T cells was detected by CCK8 assay.The level of Caspase3 protein in HEK293T cells after overexpression of fancd2os gene was detected by Western blotting.Caspase3 fluorescent staining kit was used to analyze the apoptosis of HEK293T cells induced by UV.The effects of overexpression of fancd2os gene on ultraviolet-induced apoptosis and mitochondrial membrane potential in HEK293T cells were detected by flow cytometry.The result of the study was: 1.The results of real-time quantitative PCR showed that fancd2os mRNA was expressed in all four cell lines, but the expression level in TM3 was relatively high. 2. Western blotting analysis showed that FANCD2OS protein was expressed in all of the four cell lines, and the expression level in TM3 was higher than that in TM3.Immunohistochemistry and immunofluorescence staining showed that FANCD2OS protein was mainly located in the interstitial cells of testis. 4. RT-PCR and Western blotting analysis showed that the overexpression of fancd2os gene was detected in HEK293T cell model.The cell proliferation ability was significantly higher than that of empty vector group and bare cell group. 6. The results of Western blotting showed that the content of activated Caspase3 in overexpression group was significantly higher than that in the other two groups.Fluorescence staining showed that the Caspase3 positive signal in transfection group was significantly higher than that in empty vector group and control group.Flow cytometry analysis showed that the degree of apoptosis in overexpression group was significantly higher than that in empty vector group and bare cell group, and the percentage of decrease in mitochondrial membrane potential was significantly higher than that in empty vector group and bare cell group.Conclusion: 1. Fancd2os gene was expressed in four cell lines of GC1-spgC2-spdtit TM3TM4. However, the overexpression of Fancd2os gene in TM3 could inhibit the proliferation of HEK293T cells, decrease mitochondrial membrane potential, and increase the level of intracellular activated Caspase3 protein.It can promote apoptosis.
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2;Q78

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本文編號：1724744