本文選題：二甲雙胍　切入點：上皮-間質轉化　出處：《山東大學》2014年碩士論文

【摘要】：前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,近年來,前列腺癌在我國的發(fā)病率快速增長,正日益成為嚴重威脅老年男性健康的疾病。目前臨床治療面臨的課題之一是如何針對“侵襲性”(aggressive)前列腺癌選擇高效低毒的藥物,降低復發(fā)和轉移的風險。二甲雙胍(1,1-Dimethylbiguanide)是治療Ⅱ型糖尿病最常用的藥物之一。近年來,越來越多的證據(jù)提示,二甲雙胍可以延緩部分前列腺癌患者腫瘤的生長速度并降低前列腺癌的罹患風險。但二甲雙胍的抗腫瘤機制尚未完全明確。 腫瘤的侵襲和轉移是前列腺癌病人死亡的重要原因。近年來的研究發(fā)現(xiàn),上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)與惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關。最近的研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中,二甲雙胍可抑制TGF-β信號通路促進的EMT過程,表現(xiàn)為TGFp介導的E-cadherin下調與Vimentin上調的效應消失。這一成果為后續(xù)研究提供了一定的思路和參考。由于前列腺癌和乳腺癌均為激素相關性腫瘤,我們推測二甲雙胍對前列腺癌細胞EMT的發(fā)生過程亦可能發(fā)揮重要作用,但是目前尚未有相關研究報道。 本研究使用不同濃度的二甲雙胍處理前列腺癌Vcap細胞,通過MTS比色法、流式細胞術分析、劃痕和侵襲小室實驗檢測二甲雙胍對Vcap細胞生物學行為的影響；采用RT-PCR和Western blot測定二甲雙胍對Vcap細胞上皮指標物(E-cadherin、 β-catenin)和間質指標物(Vimentin、 N-cadherin) mRNA和蛋白表達水平的影響,闡明二甲雙胍調控前列腺腫瘤細胞發(fā)生EMT過程的分子機制；使用RT-PCR檢測二甲雙胍處理Vcap細胞后1niRNA的表達水平變化,初步闡明二甲雙胍對前列腺腫瘤細胞miRNA的調控作用。 方法： 1.采用MTS法分別測定不同濃度二甲雙胍(1、5、10、5Ommol/L)處理前列腺癌Vcap細胞24、48和72h后對細胞增殖的影響。 2.流式細胞儀檢測5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞24h后細胞周期的分布變化。 3.劃痕實驗和細胞侵襲小室實驗檢測二甲雙胍對前列腺癌Vcap細胞遷移和侵襲能力的作用。 4.RT-PCR和Vestern-blot分別檢測5mmol/L二甲雙胍處理24h、48h后對Vcap細胞上皮指標物(E-cadherin、 β-catenin)和間質指標物(、Vimentin、 N-cadherin)mRNA和蛋白表達水平的影響,闡明二甲雙胍調控前列腺腫瘤細胞發(fā)生EMT過程的分子機制。 5.運用RT-PCR檢測5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞24h后對miRNA的表達水平的影響。闡明二甲雙胍對Vcap細胞1niRNA的調節(jié)作用。 6.miR30a類似物和miR30a抑制物分別作用Vcap細胞24h、48h、72h后,采用MTS法檢測對Vcap細胞增殖的影響。運用RT-PCR檢測miR30a類似物處理Vcap細胞24h后對上皮指標物(E-cadherin)和間質指標物(Vimentin) mRNA的影響。闡明miR30a在二甲雙胍調控Vcap細胞EMT中發(fā)揮的作用。 結果： 1.MTS實驗結果：二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap細胞的增殖,呈濃度和時間依賴性。 2.二甲雙胍對Vcap細胞細胞周期分布的影響：5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞48h后,與對照組相比,G0/G1期細胞比例明顯增加(54.1%vs.77.2%),而S期(13.8%vs.6.7%)和G2/M期(32.1%vs.16.1%)細胞比例均顯著減少。 3.二甲雙胍抑制Vcap細胞的遷移和侵襲能力：5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞48h后,劃痕愈合率顯著低于對照組,提示二甲雙胍處理后,腫瘤細胞的遷移能力顯著降低。侵襲小室實驗顯示5]mmol/L二甲雙胍可明顯抑制Vcap細胞的侵襲能力。與對照組細胞相比,5mmol/L二甲雙胍抑制細胞侵襲的能力達到45%以上(P＜0.01,n=3)。 4.二甲雙胍抑制Vcap細胞EMT的發(fā)生：5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞24h后,EMT相關的上皮標志物及間質標志物均發(fā)生較顯著的變化。與對照組比較,二甲雙胍處理組中,Vcap細胞的上皮性標志物E-cadherin和β-catenin的]mRNA表達水平明顯升高,分別高于對照組6.2倍(P=0.023)、1.2倍(P=0.034)；間質性標志物Vimentin和N-cadherin的mRNA水平明顯降低,分別較對照組低3.6倍(P=0.002)和2.9倍(P=0.013)。5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞48h后, Westernblot顯示E-cadherin和β-catenin的蛋白表達水平明顯升高,而Vimentin和N-cadherin的蛋白表達水平顯著降低。5.二甲雙胍對Vcap細胞]miRNA的調節(jié)作用：與對照組相比,5mmol/L二甲雙胍處理24h后,可明顯上調Vcap細胞中miR30a, miR143和miR196b的表達水平,其中,miR30a的變化效應最顯著(呈3.5倍改變),但Vcap細胞的miR185和miR205的表達水平未有明顯變化。6. miR30a對Vcap細胞增殖和EMT的影響：miR30a的類似物和抑制物分別作用Vcap細胞株24、48、72h后,與對照組相比,miR30a的類似物可明顯抑制Vcap細胞的增殖,而miR30a的抑制物可明顯促進Vcap細胞的增殖(P0.05)。進一步的試驗發(fā)現(xiàn),1niR30a的類似物作用Vcap細胞24小時后,上皮性標志物E-cadherin mRNA水平明顯增高,而間質性標志物、Vimentin的mRNA水平明顯降低。 結論： 1.二甲雙胍明顯抑制前列腺癌Vcap細胞的增殖,且呈濃度和時間依賴性。 2.二甲雙胍阻滯前列腺癌Vcap細胞進入S期,使其停留在G0/G1期。 3.二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap細胞的遷移和侵襲能力。 4.二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap上皮間質轉化的過程,該過程可能與二甲雙胍上調miR30a表達有關。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

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本文編號：1715658