本文關(guān)鍵詞：腎小管上皮細(xì)胞損傷誘導(dǎo)草酸鈣結(jié)石形成與大鼠泌尿系數(shù)字構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學(xué)》 2012年

腎小管上皮細(xì)胞損傷誘導(dǎo)草酸鈣結(jié)石形成與大鼠泌尿系數(shù)字構(gòu)建

張燊  

【摘要】：1研究背景及目的 泌尿系結(jié)石(Urolithiasis)是泌尿系統(tǒng)的常見疾病,迄今為止,對尿石形成的預(yù)防尚無十分理想的方法,80%以上的患者病因不清。在外科治療方面結(jié)石病的治療主要有經(jīng)皮腎造瘺,輸尿管鏡取石等多種微創(chuàng)外科技術(shù)與體外碎石(ESWL)治療,泌尿系結(jié)石治療后復(fù)發(fā)率為30%-50%。如果能夠從結(jié)石形成的機制出發(fā),研制出對延緩結(jié)石形成的針對性藥物,有極其重要的臨床價值。結(jié)石的形成亦受到流體動力學(xué)等因素的影響,用計算機模擬有限元分析的方法來進(jìn)行研究成為目前的熱點,這就涉及到計算機建模的問題。如能利用相對較少的解剖數(shù)據(jù),對泌尿系進(jìn)行參數(shù)化構(gòu)建,不僅可滿足泌尿外科實驗研究的需求,同時也能為泌尿外科動物實驗及虛擬手術(shù)提供一個良好的平臺。 根據(jù)研究目的我們的研究分為四個部分： ①對非洲綠猴腎小管上皮細(xì)胞采用體外培養(yǎng)的方法,采用H202對其進(jìn)行損傷,觀察損傷前后細(xì)胞成活率,并按損傷時間順序測定細(xì)胞與氧化損傷有關(guān)的酶及大分子的表達(dá),細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的變化以及對草酸鈣晶體成核和聚集的影響。 ②對人近曲腎小管上皮細(xì)胞采用體外培養(yǎng)的方法,采用H202對其進(jìn)行損傷,觀察損傷前后細(xì)胞成活率,并按損傷濃度測定細(xì)胞與氧化損傷有關(guān)的酶及大分子的表達(dá),細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的變化以及對草酸鈣晶體成核和聚集的影響。 ③對日產(chǎn)大豆多糖進(jìn)行提純,并在體外尿液體系中進(jìn)行相應(yīng)檢測,在非洲綠猴腎小管上皮細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上,研究提純前后的大豆多糖對Vero細(xì)胞中草酸鈣晶體生長的調(diào)控作用。 ④使用Autodesk3ds Max8SP2軟件,對COM及COD晶形及結(jié)石進(jìn)行模擬；根據(jù)大鼠實體解剖,綜合運用放樣、布爾運算、多邊形造模、倒角剖面和車削等手段,對腎、腎上腺、血管、膀胱、氣管、甲狀腺和血管等器官進(jìn)行真實比例構(gòu)建,合并到手術(shù)場景中,經(jīng)渲染后獲取各角度的三維圖像。 目前對實驗用腎細(xì)胞的分類一般是根據(jù)動物來源進(jìn)行劃分的。最早培養(yǎng)的細(xì)胞來自于鼠,包括NRK-52E,髓質(zhì)集合管細(xì)胞(pIMCD),大鼠的近端小管細(xì)胞(pMPT)等；第二種細(xì)胞來源于狗,如Madin-Darby犬齒腎細(xì)胞(MDCK);第三種來源于猴,如非州綠猴腎上皮細(xì)胞(BSC-1);第四種來源為豬,比如LLC-PK1;第五個來源為人,比如人的腎上皮細(xì)胞(HK-2)。在這里我們選取非洲綠猴腎小管上皮細(xì)胞(Vero)及人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HKC)兩種細(xì)胞株進(jìn)行了研究。 大豆多糖(SPS)是從大豆分離蛋白、豆腐和腐竹等生產(chǎn)加工的副產(chǎn)物豆渣纖維中提取,經(jīng)過預(yù)處理、酶解(纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等)、分離、脫色、滅菌、干燥等工藝精制而成,且具有來源廣,價格低廉和無副作用等優(yōu)點。分析表明,SPS主要成分是半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸,并含有鼠李糖、巖藻木糖及葡萄糖等多種成分。其結(jié)構(gòu)是以鼠李半乳糖醛酸和高聚半乳糖酸為主鏈,半乳聚糖和阿拉伯糖為側(cè)鏈結(jié)合的近似于球狀結(jié)構(gòu)體,具有良好的分散性、水溶性和乳化性等特點。在這里我們的研究采用過氧化氫(Sevag)法來降解日產(chǎn)大豆多糖。 3D Studio Max軟件是Kinetix(Autodesk公司的多媒體商業(yè)機構(gòu))推出的一個動畫產(chǎn)品。使用它可以在PC機上得到真正的工作站動畫軟件的性能和圖像質(zhì)量。其經(jīng)過不斷的換代已成為目前世界上應(yīng)用最廣泛的三維建模,動畫,渲染的大眾化軟件。在這里我們使用的是軟件Autodesk3ds Max8SP2(美國,Autodesk公司,ID：666-12345678),操作平臺為windows XP系統(tǒng)。 2研究方法 2.1VERO細(xì)胞損傷模型建立 非洲綠猴腎小管上皮細(xì)胞株VERO購自中科院上海細(xì)胞庫(編號：GN017),用含有10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng),保持37℃及飽和濕度環(huán)境,每隔1天更換1次培養(yǎng)液。根據(jù)實驗設(shè)計加入含有不同濃度H202的無血清培養(yǎng)液,細(xì)胞消化采用胰蛋白酶消化法,當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%-90%融合后,用PBS液洗滌細(xì)胞2次,用0.02%EDTA與0.25%Trypsin消化細(xì)胞,3-5min后于倒置顯微鏡下觀察消化程度；當(dāng)大部分細(xì)胞變圓,細(xì)胞分離散開,表明消化適度,加入含10%新生小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化,充分吹打細(xì)胞使其形成單細(xì)胞懸液。用CCK-8法來檢測H202造成細(xì)胞損傷的程度,用酶標(biāo)儀在450nm處測量吸光度(A),計算細(xì)胞存活率(%),并繪制存活率-時間曲線和存活率-濃度曲線,細(xì)胞存活率(%)=A(實驗組)/A(對照組)×100% 2.2人腎小管上皮細(xì)胞損傷模型建立 人腎小管上皮細(xì)胞由上海長征醫(yī)院梅長林教授饋贈。細(xì)胞培養(yǎng)的條件同前,細(xì)胞采用不同濃度H202進(jìn)行損傷,細(xì)胞種植培養(yǎng)液中含雙氧水0.1,0.3,0.5,1.0以及2.0mmol/L H2O2的培養(yǎng)基中1h。對照組培養(yǎng)液不含H202。在指定的時間點,吸出培養(yǎng)液,細(xì)胞用PBS洗兩次,并加入新鮮的培養(yǎng)基。然后,每孔加入10μ1的CCK-8。孵育4h后,450nm酶標(biāo)儀檢測。 2.3細(xì)胞MDA和SOD濃度 采用雙抗體夾心法測定細(xì)胞中MDA、SOD濃度,包被單抗的微孔中依次加入丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD),再與HRP標(biāo)記的MDA/SOD抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化作用下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色深淺和樣品中的丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD)正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中丙二醛(MDA)／超氧化物歧化酶(SOD)的濃度。 2.4細(xì)胞的OPN表達(dá) 細(xì)胞加入4%多聚甲醛固定10min,再用PBS洗三次,每次3min；加入羊血清封閉20min,滴加入骨橋蛋白一抗(1：100),4℃過夜。PBS洗三次,避光滴加FITC二抗(1：100),37℃孵育30min后,PBS洗三次,最后用DAPI給細(xì)胞染色并封片,激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。細(xì)胞核為藍(lán)色,骨橋蛋白顯綠色。 2.5SEM, XRD分析 細(xì)胞結(jié)晶孵育后,取出蓋玻片,用PBS液洗滌細(xì)胞2次,加入2.5%戊二醛固定24h,1%OsO4將細(xì)胞后固定,再用PBS液洗滌3次,梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)脫水,再用乙酸異戊酯固定后CO2臨界點干燥,噴金包被。用SEM觀察細(xì)胞形態(tài)和晶體生長情況,同時對蓋玻片上的晶體進(jìn)行XRD檢測(5°2060°),確定晶體組分。 2.6細(xì)胞Zeta電位檢測 細(xì)胞清洗后,用PBS洗去未粘附的晶體,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液,充分吹打細(xì)胞,使細(xì)胞和晶體脫落,以1,000rpm/s離心收集細(xì)胞和晶體,吸除上清液,加入1000μl pH=7.86的PBS緩沖液使細(xì)胞和晶體重新懸浮,于樣品池中吸取約8001μ1懸浮液,用納米粒度儀測其Zeta電位。 2.7共培養(yǎng)后測量CaOxa的濃度 細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)加入含有亞穩(wěn)定的CaOxa溶液間質(zhì)孵育6h。取出6孔板中的載玻片,然后用PBS洗滌以去除沒有結(jié)合的晶體。 載玻片放于25m1燒杯中。然后,倒入10mlHNO3和0.5ml HClO4,樣品在電爐中消化直到清晰的固化形成。樣品不斷地加熱直到HClO4沸騰,冒煙,直至干掉。加熱干燥后置于室溫冷卻。然后,燒杯中加入3.0m1水溶解殘留。溶液中Ca2＋濃度用ICP方法測量。CaOxa晶體的數(shù)量使用Ca2+濃度來測量,結(jié)果用微克／每平方厘米表示。 2.8大豆多糖的提取 采用Sevag法對SPS進(jìn)行處理以除去SPS中可能存在的少量蛋白。向多糖溶液中加入0.2倍體積的Sevag試劑(V氯仿：V正丁e=5：1),將混合液劇烈振蕩15分鐘后離心(4000rpm,10min),此時溶液分為兩層,上層為多糖溶液,下層為Sevag試劑與變性蛋白生成的凝膠。取上層液,再加入0.2倍體積的Sevag試劑,重復(fù)上述操作,共5次,合并水相,從中提取多糖。 利用過氧化氫(H202)對SPS進(jìn)行降解。稱取1.2g多糖,用60m1蒸餾水溶解于100ml燒杯中,70℃條件下水浴攪拌溶解。溶解完畢后,迅速加入15m1體積分?jǐn)?shù)為30%的H202,降解1.5h后,待溶液冷卻,用濃度為2mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值到7。然后將溶液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中,在70℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),待溶液體積減少至原體積的1／3時停止蒸發(fā),加入60ml的無水乙醇沉淀多糖過夜,將沉淀過濾,干燥之后進(jìn)行稱重。 2.9多糖理化性質(zhì)測定 采用苯酚-硫酸法測定了SPS中多糖的百分含量；采用粘度法測定降解前后SPS的平均相對分子質(zhì)量。 2.10泌尿系結(jié)石數(shù)字構(gòu)建 COM與COD單晶模型COM按六方體建模,先按比例建成圓柱形,邊數(shù)設(shè)為6,雙底面各頂點采用多邊形編輯命令調(diào)整頂點位置。COD按四角雙錐建模,先半高構(gòu)建四棱錐,再用鏡相命令于Z軸復(fù)制另一半,兩個四棱錐成組。選用透明玻璃材質(zhì)球,調(diào)整參數(shù)為顏色白色,透明度40,半透明80,折射率1.5,亮度200,賦予晶體材質(zhì)。 結(jié)石模型使用圓球體,保持表面光滑。先用FFD4×4×4圓柱體調(diào)整表面,再利用噪波分別于X、Y、z軸設(shè)置0-100的數(shù)值,材料球填加合適貼圖。尿路采用管狀體造模,FFD4×4×4圓柱體調(diào)整表面,移至與結(jié)石相適應(yīng)的部位。分別渲染生成圖片。 2.11大鼠泌尿系數(shù)字構(gòu)建 使用Autodesk3ds Max8SP2軟件運用放樣、布爾運算、多邊形造模、倒角剖面和車削等手段,對腎、腎上腺、血管、膀胱、氣管、甲狀腺和血管等器官進(jìn)行真實比例構(gòu)建,合并到腹部及頸部手術(shù)場景中,并安裝自由攝像頭經(jīng)渲染后獲取各角度的三維圖像。 2.12統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS13.0軟件。數(shù)據(jù)表達(dá)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示(χ-±s)。細(xì)胞存活率檢測采用One-Way ANOVA或Two-Way ANOVA方法,MDA、SOD, OPN表達(dá),結(jié)晶體大小,數(shù)目等采用One-Way ANOVA方法檢驗,先進(jìn)行Levene檢驗方差齊性,若P0.05,選擇基于方差齊性的方差分析結(jié)果；若P0.05選擇基于方差不齊的方差分析結(jié)果(Welch法)。若方差分析顯著后,則進(jìn)一步多重比較,方差齊者采用LSD法比較,方差不齊者采用Games-howell比較法。降解前、后SPS的含糖量檢測采用配對樣本t檢驗。P0.05認(rèn)為是差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3結(jié)果 1濃度為0.15mmol/LH2O2可以明顯的損傷Vero細(xì)胞并在0.5h-2h內(nèi)按時間相關(guān)地減小細(xì)胞存活率； 2細(xì)胞損傷后,MDA濃度和OPN表達(dá)上升,而SOD水平減低； 3損傷的Vero細(xì)胞容易導(dǎo)致草酸鈣晶體的成核及聚集,誘導(dǎo)更多的COM結(jié)晶形成； 4損傷Vero細(xì)胞表面的Zeta變化比正常細(xì)胞更為劇烈,幾乎呈線性上升。 5H202會明顯的損傷HKC細(xì)胞,且在0.1～2mmol/L濃度范圍內(nèi)隨著劑量的增加會使細(xì)胞存活率下降。 6在細(xì)胞損傷后,MDA濃度以及OPN表達(dá)會升高,而SOD水平下降,這就會引起損傷細(xì)胞誘導(dǎo)的草酸鈣晶體數(shù)目的增多。 7正常細(xì)胞的表面初始Zeta電位高于損傷細(xì)胞,損傷細(xì)胞在c(H2O2)=0～1.5mmol/L的范圍內(nèi),隨其濃度的升高其細(xì)胞表面的Zeta電位呈一直下降的趨勢,而加入晶體后,Zeta電位會先下降再上升的再趨于平緩。說明細(xì)胞表面Zeta電位的下降可以為CaOxa晶體粘附提供更多的位點。 8通過雙氧水對水溶性的大豆多糖進(jìn)行降解,降解后大豆多糖去除了蛋白成分,含糖量顯著的減少,且分子量由98,000降低到28,379； 9降解前、后的大豆多糖均能有效的抑制COM晶體的形成,但降解后的小分子量大豆多糖體現(xiàn)出更強的分子活性,對草酸鈣晶體的調(diào)控作用進(jìn)一步的增強。 10SPS可以提高損傷Vero細(xì)胞的線粒體的膜電位。 11Vero細(xì)胞經(jīng)SPS作用后,細(xì)胞的形貌能逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài),且其能誘導(dǎo)更多COD晶體的生成。 12用降解后小分子量SPS對損傷Vero細(xì)胞修復(fù)后,其誘導(dǎo)了尺寸較小的草酸鈣聚集體。 13利用3D Studio Max軟件,構(gòu)建出結(jié)石單晶及泌尿系結(jié)石三維模型。 14采取相對簡單的方法和較少的數(shù)據(jù)在個人PC機上成功構(gòu)建出大鼠泌尿系參數(shù)化模型。 15在手術(shù)場景中進(jìn)行合并,模擬出大鼠原位,髂位及頸部腎移植情況。 4討論 本研究采用化學(xué)及生物學(xué)分析的研究方法,建立了穩(wěn)定的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型,摸索出了一套細(xì)胞體外化學(xué)測試方法。這可以為生物礦化與臨床診斷相結(jié)合提供了依據(jù),利用生物統(tǒng)計學(xué)的方法設(shè)計實驗及分析數(shù)據(jù),使得出的結(jié)論更為客觀、準(zhǔn)確。同時利用相對較少的解剖數(shù)據(jù),使用3D Studio Max軟件模仿結(jié)石的晶體及全貌,并對大鼠的泌尿系統(tǒng)進(jìn)行參數(shù)化構(gòu)建,模擬出大鼠原位及異位腎移植場景,以滿足泌尿外科動物解剖實驗的需求,同時也為泌尿系流體分析及虛擬手術(shù)提供一個良好的平臺。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R692.4
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：腎小管上皮細(xì)胞損傷誘導(dǎo)草酸鈣結(jié)石形成與大鼠泌尿系數(shù)字構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：165954