本文關(guān)鍵詞： 急性腎損傷 缺血再灌注損傷 VEGF-C NRP-2 血清剝奪 凋亡 自噬　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因C(VEGF-C)在腎缺血再灌注動(dòng)物模型中表達(dá)的變化以及VEGF-C及其受體NRP-2對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)的大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)凋亡和自噬的作用及機(jī)制。 方法(1)觀察小鼠腎缺血再灌注模型中VEGF-C的表達(dá)變化：構(gòu)建小鼠腎缺血再灌注模型,收集并檢測(cè)各組血清總Scr, BUN的水平,PAS染色觀察腎臟的病理?yè)p傷程度,免疫組織化學(xué)法及Western Blot檢測(cè)VEGF-C的表達(dá)與分布。(2)觀察VEGF-C及受體NRP-2對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響：血清剝奪不同時(shí)間刺激NRK52E細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)血清剝奪不同時(shí)間點(diǎn)激活型caspase3和總caspase3的表達(dá)變化；用小分子siRNA干擾技術(shù)分別沉默VEGF-C, NRP-2的表達(dá),利用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)VEGF-C, NRP-2沉默對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的影響,Western Blot檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)變化；用不同濃度的重組VEGF-C因子預(yù)處理細(xì)胞,利用CCK-8法檢測(cè)外源性加入VEGF-C對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞活性改變的影響。(3)觀察VEGF-C及受體NRP-2對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞自噬的影響：血清剝奪不同時(shí)間刺激NRK52E細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)血清剝奪不同時(shí)間點(diǎn)LC3的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)LC3表達(dá)及分布情況；透射電鏡觀察血清剝奪誘導(dǎo)后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)改變；用小分子siRNA干擾技術(shù)分別沉默VEGF-C, NRP-2的表達(dá),Western Blot檢測(cè)VEGF-C, NRP-2沉默對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)LC3的表達(dá)變化的影響；在血清剝奪的條件下,加入不同濃度的巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1), CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性的改變；Western Blot檢測(cè)加入Bafilomycin A1后VEGF-C沉默對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)LC3的表達(dá)變化的影響。 結(jié)果(1)缺血再灌注損傷后,小鼠血肌酐和尿素氮上升,缺血再灌注24h時(shí)腎功能損傷最明顯,而缺血再灌注48h時(shí)腎功能已經(jīng)有部分恢復(fù)。與假手術(shù)組比較,缺血再灌注損傷后腎組織可見(jiàn)腎小管管腔擴(kuò)張,伴管型形成,腎小管上皮細(xì)胞腫脹壞死及空泡變性,刷狀緣壞死脫落,并且伴有炎性細(xì)胞侵潤(rùn),而腎小球未見(jiàn)明顯的病變。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,缺血再灌注24h組小鼠腎臟VEGF-C表達(dá)增加,并且主要表達(dá)在腎臟皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)部的腎小管。Western blot結(jié)果顯示隨著缺血后再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),小鼠腎組織VEGF-C蛋白的表達(dá)逐漸增加。(2)隨著血清剝奪時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞激活型caspase3的表達(dá)增高,而總caspase3的表達(dá)減少；利用siRNA技術(shù)分別沉默NRK52E細(xì)胞VEGF-C和NRP-2的表達(dá)后,血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平均明顯增加；血清剝奪刺激后,Bcl-2蛋白表達(dá)下降,而沉默VEGF-C能進(jìn)一步降低Bcl-2蛋白的表達(dá)；外源性加入VEGF-C能抑制血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降。(3)隨著血清剝奪時(shí)間的延長(zhǎng),LC3II蛋白的表達(dá)逐漸增加；血清剝奪誘導(dǎo)后LC3在胞漿點(diǎn)狀聚集增多；透射電鏡下觀察到血清剝奪誘導(dǎo)后細(xì)胞線粒體腫脹,細(xì)胞內(nèi)空泡變性顯著增多,并可以見(jiàn)到降解自噬囊泡；分別沉默VEGF-C和NRP-2的表達(dá)后,能進(jìn)一步增加血清剝奪誘導(dǎo)的LC3II的蛋白表達(dá)；在血清剝奪環(huán)境下,Bafilomycin A1能使細(xì)胞活力進(jìn)一步降低,并呈濃度依耐性；加入Bafilomycin A1后,VEGF-C干擾組的細(xì)胞LC3表達(dá)變化的比值均低于對(duì)照siRNA組。 結(jié)論腎缺血再灌注損傷后腎臟組織中VEGF-C的表達(dá)上升,提示VEGF-C與腎缺血再灌注損傷之間存在著密切的關(guān)系；VEGF-C及其受體NRP-2能維持腎小管上皮細(xì)胞在血清剝奪環(huán)境下的存活,減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡：VEGF-C及其受體NRP-2參與調(diào)控血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R692

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