本文關(guān)鍵詞： ABCG2 FTC 腎癌 藥物抵抗 舒尼替尼 裸鼠　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的:腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于膀胱癌,居泌尿系腫瘤的第2位。約30%的RCC患者在診斷原發(fā)腫瘤時(shí)已有轉(zhuǎn)移灶,另外約30%-40%的患者術(shù)后一年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。RCC是一種對(duì)放療和化療均不敏感的實(shí)體瘤,其病因和病理機(jī)制尚不完全清楚。雖然臨床上對(duì)于中晚期腎癌的靶向治療取得了非常可喜的臨床療效(國內(nèi)外報(bào)道的疾病控制有效率均在80%左右),但臨床上仍有一部分的患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展,影響了患者的長期存活。蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib)是一種常用的口服多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物,屬于多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs)。目前對(duì)于腫瘤的多重藥物抵抗(Multidrug Resistance,MDR,)仍是治療失敗的主要因素,如何逆轉(zhuǎn)腫瘤的藥物抵抗,提高腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性,成為人們越來越關(guān)注的話題。有研究表明三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ATP-Binding Cassette Transporter superfamily G member 2,ABCG2),是位于細(xì)胞膜上的耐藥相關(guān)半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,起著“藥物泵”的作用,與治療藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的濃度積累密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn):腎癌細(xì)胞中ABCG2呈高表達(dá),且與患者的存活率密切相關(guān);同時(shí)Sunitinib也是ABCG2的作用底物,提示ABCG2可能是腎癌產(chǎn)生藥物抵抗的重要因素之一。煙曲霉毒素C(Fumitremorgin C,FTC)被證明是ABCG2特異性抑制劑。本研究首先研究ABCG2在散發(fā)性腎癌人群中的表達(dá)情況。然后通過使用FTC特異性抑制ABCG2的功能,探討Sunitinib對(duì)腎癌細(xì)胞的體外治療效果;同時(shí)觀察ABCG2抑制劑FTC聯(lián)合Sunitinib在腎癌裸鼠皮下移植瘤模型中的治療效果。材料和方法:1調(diào)取經(jīng)病理證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌的石蠟標(biāo)本共120例和因腎積水失功的腎組織石蠟標(biāo)本10例,切片后按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行ABCG2免疫組化染色。2經(jīng)Western Blot法檢測并選擇ABCG2蛋白相對(duì)高表達(dá)的3珠腎癌細(xì)胞株,尋找這3株細(xì)胞株Sunitinib的IC50濃度,聯(lián)合使用ABCG2的特異性抑制劑FTC和Sunitinib,采用CCK-8檢測、流式細(xì)胞儀分析法觀察聯(lián)合治療對(duì)這3種細(xì)胞株的存活率及凋亡水平;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FTC處理前后腎癌細(xì)胞中Sunitinib的積累及外排比例;采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察FTC處理前后細(xì)胞增殖水平;通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察FTC處理對(duì)腎癌細(xì)胞遷移的影響。3取5周齡的雄性BLAB/c nu裸鼠18只,隨機(jī)分為3組,分別為:空白對(duì)照組、Sunitinib單藥組、Sunitinib+FTC聯(lián)合組。使用瘤細(xì)胞懸液接種法建立786-O人腎癌裸鼠皮下移植瘤模型。藥物干預(yù)如下:Sunitinib使用灌胃,一周5次連續(xù)2周,濃度控制在100 mg/kg體重;第15天起,聯(lián)合治療組給予0.1 ml FTC溶液于瘤體內(nèi)少量多點(diǎn)注射,給藥量20 nmol。37天后處死小鼠,觀察腫瘤瘤體積和重量變化。結(jié)果:1在120例腎癌組織中,有63例ABCG2表達(dá)為陽性,陽性率為52.5%。陽性表達(dá)部位主要出現(xiàn)在癌細(xì)胞的細(xì)胞膜,呈棕黃色,條帶狀。在10例非腎癌組織中,ABCG2都呈陰性表達(dá)。采用Fisher精確概率分析結(jié)果顯示:在腎癌組織和非腎癌組織中ABCG2表達(dá)的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。在腎癌組織中ABCG2的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤最大徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Furhman分級(jí)無關(guān)(P0.05);而與是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及5年存活率有關(guān)(P0.05)。120例腎癌患者5年總生存率為80.8%,其中ABCG2陰性組為94.7%,ABCG2陽性組(+~+++)為68.3%,組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。兩組的OS分別為86.3±22.5個(gè)月和61.4±33.0個(gè)月,P0.001。2 ABCG2在786-O、ACHN、OS-RC-2這3種細(xì)胞株中呈相對(duì)高表達(dá),舒尼替尼對(duì)于這3種腎癌細(xì)胞株的IC50在2μM左右。聯(lián)合使用ABCG2的特異性抑制劑FTC和Sunitinib能有效抑制腎癌細(xì)胞增殖,平均抑制率分別為63.8%、46.3%、45.3%,在與786-O和OS-RC-2中跟Sunitinib單藥組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。聯(lián)合應(yīng)用能有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,凋亡率分別為13.5%、25.8%、17.4%,與單藥組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。FTC處理后,癌細(xì)胞內(nèi)Sunitinib平均積累率分別為:142.3%、151.7%、148.0%,而平均外排率分別為:74.9%、61.5%、69.7%,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Sunitinib+FTC聯(lián)合治療組細(xì)胞克隆的形成數(shù)量明顯減少(P0.05);Transwell實(shí)驗(yàn)提示遷移的細(xì)胞數(shù)無明顯變化。3成功構(gòu)建786-O人腎癌裸鼠模型,按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行藥物干預(yù)(Sunitinib采用灌胃的方式,而FTC進(jìn)行移植瘤局部皮下注射)。實(shí)驗(yàn)第37天進(jìn)行動(dòng)物處死及移植瘤的剝離,Sunitinib+FTC聯(lián)合用藥組的腫瘤體積明顯小于Sunitinib單藥組或空白對(duì)照組,分別為320.3mm3、582.0mm3和825.3mm3,組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。聯(lián)合用藥組的腫瘤重量明顯小于Sunitinib單藥組或空白對(duì)照組,分別為249.5mg、339.7mg、421.3mg,組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Sunitinib+FTC聯(lián)合治療組相對(duì)于Suninib組的瘤重抑制率(%)IR為26.6%;Sunitinib相對(duì)于空白對(duì)照租的IR為16.0%。結(jié)論:1 ABCG2在腎癌組織中呈部分表達(dá)(52.5%),較非腎癌組織表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ABCG2的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及5年存活率有關(guān)(P0.05)。2聯(lián)合使用ABCG2的特異性抑制劑FTC和Sunitinib,具有體外抑制人腎癌細(xì)胞(786-O、ACHN、OS-RC-2)增殖的作用,并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡;但對(duì)癌細(xì)胞的遷移無明顯影響。其機(jī)制可能是FTC抑制腎癌細(xì)胞表面的ABCG2的功能,從而提高Sunitinib藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度,最終增強(qiáng)了Sunitinib對(duì)腎癌細(xì)胞的殺傷、抑制作用。3 Sunitinib能夠抑制786-O細(xì)胞在裸鼠皮下瘤體的增殖能力,同時(shí)發(fā)現(xiàn)ABCG2抑制劑FTC能夠加強(qiáng)Sunitinib抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。4本研究擬為臨床克服腎癌藥物靶向治療障礙、提高腎癌對(duì)靶向藥物的敏感性,提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : Renal cell carcinoma ( RCC ) is one of the most common malignant tumors in the urinary system . Its incidence is second only to bladder cancer . It is not completely clear in 30 % of RCC patients . The expression of ABCG2 in renal cancer cells was investigated by Western Blot . The results showed that ABCG2 was a potent inhibitor of ABCG2 . Results : The expression level of ABCG2 was 86.3 % , 46.3 % , 45.3 % in renal cell carcinoma . The results showed that the positive rate of ABCG2 was 86.3 % , 46.3 % and 45.3 % respectively . Compared with the control group , the number of cells in the combined therapy group was significantly decreased ( P0.05 ) . The number of cells in the combined treatment group was significantly decreased ( P0.05 ) . Conclusion : 1 ABCG2 can inhibit the proliferation of human renal cancer cells ( 786 - O , ACHN , OS - RC - 2 ) .

【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：1478285