發(fā)布時間：2018-01-30 14:17

  本文關(guān)鍵詞： β-甘油磷酸 血管平滑肌細胞 表型轉(zhuǎn)化 核心結(jié)合因子a1 性別決定區(qū)Y-box9　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：高磷是慢性腎臟�。╟hronic kidney disease, CKD）患者心血管事件十分重要的非傳統(tǒng)危險因素，血管鈣化的存在及其程度則是心血管事件的獨立預(yù)測因子。而CKD患者的血管鈣化以中膜的鈣化為突出表現(xiàn)。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管中膜最主要的細胞成分，其發(fā)生類成骨/成軟骨樣的表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其特點是出現(xiàn)骨源性基因的表達上調(diào)，尤其是核心結(jié)合因子a1（corebinding factor a1, Cbfa1）和性別決定區(qū)Y-box9（sex determine regionY-box9, Sox9）被視為表型轉(zhuǎn)化的標志物，但關(guān)于其表型轉(zhuǎn)化的具體方向尚未有明確定論。本研究旨在通過體外模擬高磷環(huán)境刺激大鼠VSMCs，觀察表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達的動態(tài)變化，進而探討VSMCs的表型轉(zhuǎn)化方向，為高磷誘導(dǎo)的CKD患者血管鈣化發(fā)生機制的闡明和防治提供一定的理論基礎(chǔ)。 方法： 1血管平滑肌細胞的培養(yǎng)與鑒定 去除血管外膜及內(nèi)膜后，采用組織塊貼壁法對大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞進行原代培養(yǎng)，使其經(jīng)傳代自然純化，并通過形態(tài)學(xué)及免疫細胞化學(xué)的方法對其進行細胞鑒定。 2實驗分組及處理 將生長狀態(tài)良好的對數(shù)期VSMCs隨機分為空白對照組、高磷組（HP組）及膦甲酸鈉（phosphonoformic acid, PFA）組，空白對照組培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的低糖DMEM培養(yǎng)基，HP組為10%FBS+10mmol/L β－甘油磷酸的高磷培養(yǎng)基，PFA組為10%FBS+10mmol/L β－甘油磷酸+1mmol/L PFA的PFA培養(yǎng)基，每24h更換一次培養(yǎng)基。檢測給予刺激后6h、12h、1d-5d中表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的動態(tài)表達情況。 3高磷誘導(dǎo)后相關(guān)基因mRNA的表達情況 應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法測定空白對照組及HP組不同時間點VSMCs中Cbfa1、Sox9、II型膠原a1（type II collagen a1, ColIIa1）、X型膠原a1（type X collagen a1, Col Xa1） mRNA的表達情況，以GADPH為內(nèi)參，所有基因均采用同管擴增。 4HP組及PFA組Cbfa1的表達情況 應(yīng)用RT-PCR及Western blot法測定HP組及PFA組不同時間點VSMCs中Cbfa1在mRNA及蛋白水平的表達情況。 5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（x s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間均數(shù)兩兩比較采用S-N-K檢驗（Student-Newman-Keuls, SNK）。以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1VSMCs原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)3d即可見組織塊邊緣有細胞爬出，約6～7d后融合成片，即可傳代。倒置相差顯微鏡檢觀察，細胞呈星型或不規(guī)則形，以梭形為主，可相互重疊生長，可見典型的束狀排列和“峰-谷”樣生長。HE染色：鏡下可見細胞胞漿豐富，細胞核大，呈圓形或橢圓形，可見一個或多個核仁。免疫細胞化學(xué)法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），可見在細胞胞漿內(nèi)有強陽性表達，免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，沿著細胞長軸呈細絲狀排列，98%以上細胞可見強陽性表達。 2HP組表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因mRNA的表達情況 隨著高磷誘導(dǎo)時間的延長，Cbfa1mRNA的表達呈先上升、后下降、而后再次升高的趨勢（P0.05），即其表達變化呈“峰-谷-峰”樣，且分別于6h和3d達到峰值；而Sox9則僅在1d時達峰，呈“單峰”，且其達峰時間處于Cbfa1的谷值和第二峰值之間。而作為Sox9下游基因的II型膠原a1的變化與之類似，呈“單峰”（P0.05）；而作為Cbfa1下游基因以及肥厚軟骨細胞標志物的X型膠原a1則在初期維持基礎(chǔ)的低水平，而在Cbfa1第二次出現(xiàn)峰值后表達顯著升高（P0.05）。 3HP組和PFA組Cbfa1mRNA和蛋白的表達情況 隨著高磷刺激時間的延長，Cbfa1mRNA和蛋白的表達均呈“雙峰”樣（P 0.05），分別于6h及3d達峰；而PFA組則表現(xiàn)為第二高峰前移，分別于6h及1d達峰（P 0.05），且第二峰值低于第一峰值（P 0.05）。 結(jié)論: 1高磷刺激大鼠VSMCs后Cbfa1、Sox9及其下游基因mRNA的動態(tài)變化符合軟骨細胞分化的特點，進而推測高磷可能誘導(dǎo)大鼠VSMCs發(fā)生了類似軟骨細胞樣的表型轉(zhuǎn)化。 2用PFA抑制大鼠VSMCs對磷的攝取后Cbfa1表達的第二高峰前移，可能對抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化后的進一步分化起一定作用。
[Abstract]:Objective: high phosphorus is a chronic kidney disease (chronic kidney, disease, CKD) of cardiovascular events in patients with very important non traditional risk factors exist, and the degree of vascular calcification is an independent predictor of cardiac events. CKD patients with vascular calcification in membrane calcification is prominent. Vascular smooth muscle cells (vascular smooth muscle cells, VSMCs) is the main component of cell membrane of blood vessels, the osteoblast like phenotype / cartilage like transformation is the key link of vascular calcification, which is characterized by increased osteogenic gene expression, especially the core binding factor a1 (corebinding factor a1, Cbfa1) and Y-box9 (sex determining region sex determine regionY-box9, Sox9) was considered a sign of phenotypic changes, but on the specific direction of the phenotype has not been clearly determined. The purpose of this study is to simulate high phosphorus environment by in vitro stimulation in rats VSMCs, we observed the dynamic changes of gene expression related to phenotypic transformation, and further explored the direction of phenotypic transformation of VSMCs, providing a theoretical basis for the elucidation and prevention of the mechanism of vascular calcification in patients with CKD induced by high phosphorus.
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本文編號：1476441