發(fā)布時間：2017-10-30 09:21

  本文關(guān)鍵詞：單側(cè)輸尿管梗阻大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織和血漿中microRNA-21的表達(dá)及意義

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【摘要】：背景：腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)是包括移植腎相關(guān)疾病在內(nèi)的各種腎臟病發(fā)展為終末期腎衰竭的共同病理路徑。慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的病因主要包括原發(fā)性腎小球腎炎、高血壓腎病、繼發(fā)性腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎小管間質(zhì)病變、遺傳性腎病等,在發(fā)達(dá)國家,糖尿病腎病和高血壓腎病已成為CKD的主要原因,而在我國,上述兩種疾病在各種病因中仍處于原發(fā)性腎小球腎炎之后,但近年也有明顯增加趨勢。近10余年以來,國際范圍CKD的流行病學(xué)研究廣受關(guān)注,在美國等發(fā)達(dá)國家的全國性調(diào)查顯示,CKD是常見的慢性疾病,CKD在成年人群中患病率為10.2%-13.0%。在中國由王海燕教授牽頭的“中國慢性腎臟病流行病學(xué)調(diào)查”采用多階段分層抽樣設(shè)計,獲得能夠代表中國成年人群的調(diào)查對象共計47204人,評價調(diào)查結(jié)果顯示,中國18歲以上人群中CKD患病率為10.8%,據(jù)此估算,我國目前有CKD患者將達(dá)到1.2億例。根據(jù)發(fā)達(dá)國家的統(tǒng)計數(shù)據(jù),CKD患者中約有2%患者會進(jìn)入終末期腎衰竭階段,需要接受腎移植或者透析治療來維持生命；按照每例尿毒癥患者透析治療花費(fèi)10萬元人民幣/年計算,每年中國將為這些患者的透析支付2400億元人民幣。此外,CKD也與其他常見的慢性疾病之間存在復(fù)雜的交互作用,例如一項針對100萬余人的隨訪研究結(jié)果表明,與腎功能正常者相比,腎功能輕中度下降者心血管病事件增加40%,死亡率增加20%,并且隨著腎功能下降風(fēng)險呈線性增加趨勢。所以慢性腎臟病在中國已經(jīng)成為最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人體器官移植技術(shù)成為20世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得的重大進(jìn)展之一,腎移植技術(shù)已成為目前治療終末期腎病的最理想替代治療方法,雖然移植腎的近期存活率已明顯提高,但是晚期存活率并未相應(yīng)升高,遠(yuǎn)期移植腎衰竭的最主要原因就是慢性移植腎腎病(chronic allograft nephropathy, CAN),常出現(xiàn)在移植后數(shù)月至數(shù)年,CAN的主要病理學(xué)變化包括腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮、腎小球硬化,在以上病理學(xué)改變中,腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化是影響移植腎遠(yuǎn)期預(yù)后的最關(guān)鍵因素。在移植腎病理診斷中,Banff2005已經(jīng)刪除了CAN這一概念,取而代之的是間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA),并且引入了兩個新的病理類型；慢性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥(chronic T-cell mediated rejection, CTMR)和慢性抗體介導(dǎo)的排斥(chronic antibody-mediated rejection, CAMR)。目前國內(nèi)外對腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展做出了深入研究,尤其在腎間質(zhì)纖維化的信號通路研究方面取得了矚目的科研成果。大量研究證明轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad信號通路在器官纖維化的發(fā)展過程中起著主要作用,且有報告指出TGF-β1/Smad信號通路可能通過調(diào)控下游多種microRNA,從而控制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)以及纖維化,從而影響各種器官纖維化的發(fā)展過程。MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于動植物基因組中的功能性非編碼小分子RNA,大多由21至23個核苷酸構(gòu)成,可通過與靶基因mRNA特定位點(diǎn)結(jié)合,誘導(dǎo)該mRNA降解或該蛋白合成而參與各種基因的表達(dá)和調(diào)控。在目前醫(yī)療技術(shù)水平階段,慢性腎臟病以及腎移植后出現(xiàn)血肌酐升高、蛋白尿等表現(xiàn)時,組織穿刺活檢仍是病因診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但是不論是原位腎臟穿刺還是移植腎穿刺,都要面臨出血、感染等風(fēng)險,目前國內(nèi)關(guān)于]miRNA-21在腎臟纖維化機(jī)制中的作用報道較少,本實(shí)驗(yàn)通過測定miRNA-21在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstructive, UUO)大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織和血漿中的表達(dá),初步探討其在TGF-β1/Smad3信號通路中的機(jī)制及意義,進(jìn)而為尋找無創(chuàng)性檢測腎間質(zhì)纖維化特異性生物標(biāo)記物提供一定理論依據(jù)。目的：(1)檢測MicroRNA-21 (miRNA-21)在正常大鼠腎臟組織和血漿中的表達(dá),并檢測其在UUO大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織和血漿中的表達(dá),觀察分析miRNA-21在兩組中的表達(dá)差異。(2)初步探討miRNA-21在TGF-β1/Smad3致大鼠腎間質(zhì)纖維化信號通路中的機(jī)制。方法：(1)建立UUO大鼠模型：選擇20只SD雄性大鼠,隨機(jī)分為輸尿管梗阻模型組(UUO組參和假手術(shù)組(Sham組),UUO組大鼠結(jié)扎左側(cè)輸尿管,Sham組只分離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎,別于建模后第3天、第7天各采集兩組5只大鼠血液及腎臟組織進(jìn)行相關(guān)檢測。(2) miRNA-21檢測應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR (real-time qPCR)方法檢測腎臟組織及血漿中miRNA-21的表達(dá)變化：UUO組和Sham組大鼠第3天及第7天腎臟組織RNA抽提按照Trizol試劑說明書進(jìn)行,并使用紫外吸收對抽提出的RNA進(jìn)行純度和濃度檢測,使用抽提出的腎臟組織RNA進(jìn)行cDNA合成, 配備RT反應(yīng)液后在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行RT反應(yīng),各樣品的目的miRNA和內(nèi)參(U6)分別進(jìn)行Real-time qPCR反應(yīng),數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析,Sham組2-△△CT為1作為基準(zhǔn)校正。血漿nicroRNA-21檢測：使用TRI Reagent BD抽提血漿RNA,其余檢測方法同上。(3)腎臟組織病理觀察腎臟組織常規(guī)進(jìn)行包埋及切片,采用HE、masson染色和免疫組化技術(shù)評價腎組織間質(zhì)纖維化程度,使用免疫組化檢測腎臟組織中TGF-β1、Smad3、I型膠原蛋白(collagen Ⅰ, Col-Ⅰ)和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白表達(dá)情況。(4)統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示,采用單因素方差分析,方差齊性組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),若方差不齊采用Dunnett's T3法,相關(guān)性分析采用Spearman法,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：(1)兩組大鼠microRNA-21表達(dá)的變化建模后第3天和第7天UUO組腎臟組織和血漿中miRNA-21與Sham比較均升高(P均=0.000),7天UUO腎組織和血漿中miRNA-21與3天UUO相比升高(P=0.008和P=0.024),但血漿中miRNA-21表達(dá)水平不如腎臟組織明顯。(2)兩組大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察觀察HE染色切片,Sham組腎單位大小、形態(tài)均未見異常,UUO組建模后3天見腎小管輕度擴(kuò)張、小管上皮空泡樣變,間質(zhì)輕度水腫并散在炎性細(xì)胞,建模后7天即可觀察到明顯的腎間質(zhì)增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等,炎癥細(xì)胞浸潤明顯,證明建模成功。觀察masson染色大鼠腎臟組織,Sham組第3天和第7天masson染色無變化,腎單位及間質(zhì)未見異常。UUO組建模后第3天,可見腎小管管腔輕度擴(kuò)張,部分間質(zhì)可見少量淡藍(lán)色膠原組織沉積,UUO組建模后第7天,腎小管較3天模型組明顯擴(kuò)張,間質(zhì)水腫增寬明顯伴單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞廣泛浸潤,間質(zhì)膠原纖維進(jìn)行性增多、面積擴(kuò)大、藍(lán)染加重。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的masson染色膠原陽性面積評分組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=194.228,P=0.000),UUO組3天和7天腎臟組織纖維化程度評分明顯高于同時期Sham組(P=0.000和P=0.000), UUO組7天纖維化面積與3天相比顯著增多(P=0.000)。Sham組大鼠3天及7天腎臟組織中TGF-β1僅在腎小管上皮細(xì)胞中少量表達(dá),間質(zhì)中無表達(dá),且各時間點(diǎn)無明顯變化。與Sham組相比,UUO組3天、7天TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞和組織間質(zhì)表達(dá)面積隨時間逐漸增多,陽性染色逐漸加深。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的腎臟組織TGF-β1陽性面積組間存在顯著差異(F=423.844,P=0.000),UUO組TGF-β1|陽性面積與同時期：Sham組比較統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P=0.000和P=0.000),UU07天TGF-β1陽性面積較UU03天組增多(P=0.000)。Sham組大鼠3天及7天腎臟組織中Smad3蛋白表達(dá)無明顯變化,表達(dá)于少部分‘腎小管上皮細(xì)胞中。UUO組3天、7天Smad3與Sham組相比,在腎小管上皮細(xì)胞、組織間質(zhì)表達(dá)面積明顯增多,且強(qiáng)陽性表達(dá)于UUO組7天組織。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的腎臟組織Smad3陽性面積組間存在顯著差異(F=768.544,P=0.000),兩兩比較UUO組Smad3陽性面積明顯多于同時期Sham組(P=0.000和P=0.000),UU07天Smad3陽性面積多于UU03天(P=0.000)Sham組Col-Ⅰ在腎小管間質(zhì)少量表達(dá),與同時間Sham組比較,UUO組大鼠腎臟組織Col-Ⅰ蛋白表達(dá)面積明顯增多,建模后時間越長,陽性面積表達(dá)越多。組間Col-Ⅰ表達(dá)面積具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(F=1108.079,P=0.000),各組間兩兩比較,UUO組Col-Ⅰ陽性面積多于同時期Sham組(P=0.000),UU07天Col-Ⅰ陽性面積多于UU03天(P=0.000)。α-SMA在Sham組陽性面積較少,UUO組α-SMA在腎組織間質(zhì)中表達(dá)面積隨建模后時間延長增多,7天陽性染色最深。組間α-SMA表達(dá)面積具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(F=292.363,P=0.000),各組間兩兩比較,UUO組α-SMA陽性面積多于同時期Sham組(P=0.000),UU07天α-SMA陽性面積明顯較UU03天增多(P=0.000)。(3) MicroRNA-21與組織纖維化相關(guān)性分析UUO組腎組織和血漿中miRNA-21的表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化評分正相關(guān)(r=0.816、r=0.907,P均=0.000)；腎組織miRNA-21與TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.79、r=0.849、r=0.888、r=0.882, P均=0.000)；血漿miRNA-21與TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.816、r=0.875、r=0.904、r=0.905, P均=0.000)。結(jié)論：(1)UUO大鼠腎組織和血漿中microRNA-21在建模后表達(dá)上調(diào),且間質(zhì)纖維化程度越重表達(dá)越高。(2) TGF-β1/Smad3信號通路可能是促進(jìn)下游,microRNA-21表達(dá)上調(diào),從而介導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化。
【關(guān)鍵詞】：microRNA-21 纖維化 單側(cè)輸尿管梗阻 轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad3
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-23
• 第一章 單側(cè)輸尿管梗阻大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織和血漿中microRNA-21的表達(dá)23-41
• 1.1 研究的目的和意義23
• 1.2 材料和方法23-35
• 1.3 結(jié)果35-38
• 1.4 討論38-41
• 第二章 MicroRNA-21在TGF-β1/Smad3致大鼠腎間質(zhì)纖維化信號通路中的機(jī)制初步研究41-57
• 2.1 研究的目的和意義41
• 2.2 材料和方法41-48
• 2.3 結(jié)果48-54
• 2.4 討論54-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 文獻(xiàn)綜述61-71
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 中英文對照與縮略詞表71-72
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表論文72-73
• 致謝73-75

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1117065