本文關(guān)鍵詞：小鼠睪丸3D培養(yǎng)體系的建立與成年小鼠精原干細胞富集方法的研究

  更多相關(guān)文章： 睪丸 細胞外基質(zhì) 精原干細胞 3D培養(yǎng)

【摘要】：睪丸中精子發(fā)生異常是造成男性不育的一個主要原因,在臨床上主要表現(xiàn)為少精、無精或精子畸形。為此,我們以小鼠正常睪丸組織支架作為3D培養(yǎng)支架,在體外對乳鼠睪丸細胞進行長期培養(yǎng),期望建立體外生產(chǎn)精子的技術(shù)平臺。通過3D培養(yǎng)我們成功獲得進入減數(shù)分裂時期的細胞。并且進一步研究了從成年小鼠睪丸中分離精原干細胞的方法。主要研究結(jié)果如下：1.小鼠睪丸支架的制備：采用不同濃度的SDS對周齡為4-5w的昆明白小鼠睪丸處理不同的時間制備睪丸支架,然后對制備的支架進行組織學及生物化學的檢測,篩選出制備小鼠睪丸支架的最佳條件,即1% SDS處理24h。2.乳鼠睪丸細胞的制備：從出生后5-7d的乳鼠睪丸中分離睪丸細胞,然后將其注射到小鼠睪丸支架中,進行體外3D培養(yǎng)。通過組織學、免疫組織化學、流式細胞技術(shù)、RT-PCR等技術(shù)檢測了精子發(fā)生中不同階段的細胞特異標記基因的表達,結(jié)果表明睪丸支架能夠在體外支持乳鼠睪丸細胞的分化。3.分離純化成年小鼠精原干細胞：采用兩步酶消化法分離周齡為6-8w的昆明白小鼠的睪丸細胞,然后對其進行體外培養(yǎng),通過堿性磷酸酶染色、免疫熒光染色、移植、RT-PCR檢測和流式細胞術(shù)等一系列分析、鑒定,證明成年小鼠睪丸細胞在體外培養(yǎng)3d后再用MACS方法分選精原干細胞,能夠顯著提高精原干細胞的數(shù)量。本研究為建立更為可靠的精子體外成熟的方法探索了一條可能的新路,為研究人精子體外發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：睪丸 細胞外基質(zhì) 精原干細胞 3D培養(yǎng)
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略詞表8-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 睪丸12-16
• 1.1.1 睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.1.2 精子發(fā)生過程13-14
• 1.1.3 支持細胞14-15
• 1.1.4 精子發(fā)生的調(diào)控15
• 1.1.5 生殖細胞中的分子標記15-16
• 1.2 細胞外基質(zhì)16-21
• 1.2.1 制備天然組織的ECM16-19
• 1.2.2 脫細胞后ECM的檢測19
• 1.2.3 ECM中殘留化學試劑的清除19
• 1.2.4 ECM作為生物支架的應(yīng)用19-20
• 1.2.5 ECM的研究進展20-21
• 1.3 精原干細胞的培養(yǎng)21
• 1.4 SSCs體外誘導(dǎo)精子發(fā)生21
• 1.5 結(jié)語21-22
• 第二章 制備小鼠睪丸支架22-47
• 2.1 實驗材料22-24
• 2.1.1 實驗動物22
• 2.1.2 實驗儀器耗材22
• 2.1.3 實驗試劑22
• 2.1.4 重要溶液的配制22-24
• 2.2 實驗方法24-30
• 2.2.1 小鼠睪丸脫細胞24-25
• 2.2.2 小鼠睪丸ECM組織學染色25-27
• 2.2.3 小鼠睪丸ECM生化成分測定27-30
• 2.3 實驗結(jié)果30-46
• 2.3.1 小鼠睪丸ECM的組織學染色結(jié)果30-35
• 2.3.2 小鼠睪丸ECM生化成分測定結(jié)果35-46
• 2.4 討論46
• 2.5 小結(jié)46-47
• 第三章 新生小鼠睪丸細胞3D培養(yǎng)與鑒定47-58
• 3.1 實驗材料47
• 3.1.1 實驗儀器及耗材47
• 3.1.2 實驗試劑47
• 3.1.3 重要溶液配制47
• 3.2 實驗方法47-52
• 3.2.1 制備睪丸支架47-48
• 3.2.2 分離乳鼠睪丸細胞48
• 3.2.3 向睪丸支架體注射乳鼠睪丸細胞48-49
• 3.2.4 3D培養(yǎng)后的鑒定49-52
• 3.3 實驗結(jié)果52-56
• 3.3.1 組織學染色結(jié)果52-53
• 3.3.2 免疫組化染色結(jié)果53-54
• 3.3.3 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果54-55
• 3.3.4 RT-PCR基因表達檢測結(jié)果55-56
• 3.4 討論56-57
• 3.5 小結(jié)57-58
• 第四章 成年小鼠精原干細胞的分離純化及培養(yǎng)58-73
• 4.1 實驗材料58-59
• 4.1.1 實驗儀器及耗材58
• 4.1.2 實驗試劑58
• 4.1.3 重要溶液配制58-59
• 4.2 實驗方法59-65
• 4.2.1 分離成年小鼠精原干細胞59-60
• 4.2.2 精原干細胞的純化60-62
• 4.2.3 精原干細胞鑒定62-63
• 4.2.4 成年小鼠精原干細胞純化效率提高鑒定63-65
• 4.3 實驗結(jié)果65-71
• 4.3.1 細胞培養(yǎng)結(jié)果65-66
• 4.3.2 堿性磷酸酶染色結(jié)果66-67
• 4.3.3 免疫熒光染色結(jié)果67-68
• 4.3.4 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果68-70
• 4.3.5 RT-PCR基因表達檢測結(jié)果70-71
• 4.4 討論71-72
• 4.5 小結(jié)72-73
• 結(jié)論73-74
• 致謝74-75
• 參考文獻75-79

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王寧,薛京倫;精原干細胞技術(shù)的研究進展[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2003年01期

2 陳加祥;戴群;陳月江;胡曉;徐林林;王晶磊;楊俊玲;;血清培養(yǎng)對大鼠精原干細胞生長周期的影響[J];江西醫(yī)學院學報;2006年04期

3 周結(jié)學;鄭克立;鄧春華;;精原干細胞體外培養(yǎng)分化的研究現(xiàn)狀[J];中國男科學雜志;2006年04期

4 徐富翠;吳紹華;郭勇;梅欣明;;精原干細胞體外非分化擴增的初步研究[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2006年04期

5 閆家閣;馬永臻;;精原干細胞的研究進展[J];山東醫(yī)學高等�？茖W校學報;2007年05期

6 孫擎;劉厚奇;;精原干細胞研究進展[J];解剖學雜志;2009年01期

7 胡衛(wèi);張茨;廖文彪;吳永超;申復(fù)進;;改良消化富集法提高精原干細胞富集效率的實驗研究[J];中國男科學雜志;2009年06期

8 劉陶迪;吳應(yīng)積;羅奮華;;精原干細胞移植的臨床應(yīng)用前景[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2009年19期

9 何紅媛,夏冬;精原干細胞的研究進展[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2003年03期

10 曾辛;精原干細胞的研究進展[J];中華男科學;2003年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳俠;吳應(yīng)積;羅奮華;于海泉;旭日干;;大鼠精原干細胞的分離及體外培養(yǎng)的研究[A];第十屆全國生殖生物學學術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

2 徐富翠;胡紅梅;吳紹華;;精原干細胞在成骨培養(yǎng)條件下生物學特征的研究[A];2007年中國解剖學會第十屆全國組織學與胚胎學青年學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2007年

3 余榮嬌;徐斯凡;曾辛;楊俊玲;;表皮生長因子在精原干細胞增殖中的作用及其機制研究[A];中國生理學會2004年消化內(nèi)分泌生殖學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2004年

4 畢聰明;張仕強;彭樹英;呂寧;張涌;;牛精原干細胞體外長時間存活增殖及鑒定[A];全國獸醫(yī)外科學第13次學術(shù)研討會、小動物醫(yī)學第1次學術(shù)研討會暨奶牛疾病第3次學術(shù)討論會論文集[C];2006年

5 采克俊;丁海雷;丁志麗;張易祥;張念慈;劉莉;;雞精原干細胞分離與體外培養(yǎng)的初步研究[A];中國細胞生物學學會第九次會員代表大會暨青年學術(shù)大會論文摘要集[C];2007年

6 陳云波;張易祥;張念慈;采克俊;劉莉;;白消安去除公雞精原干細胞的研究[A];中國細胞生物學學會第九次會員代表大會暨青年學術(shù)大會論文摘要集[C];2007年

7 張茨;劉春霞;王玲瓏;楊嗣星;胡云飛;;采用流式細胞術(shù)分離精原干細胞的實驗研究[A];中華醫(yī)學會第八次全國男科學學術(shù)會議論文集[C];2007年

8 陶科;涂炯炯;范立青;朱文兵;孫源;盧光t;;鼠精原干細胞培養(yǎng)體系的建立及與人精原干細胞培養(yǎng)體系的比較[A];第一屆中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會、中國動物學會生殖生物學分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

9 唐立新;范雙喜;文任乾;江芳;徐姍姍;鄧順美;馬春杰;唐運革;;大鼠精原干細胞的分離純化[A];第一屆中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會、中國動物學會生殖生物學分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

10 胡建新;何堅;;精原干細胞體外技術(shù)的進展[A];2007年貴州省醫(yī)學會泌尿外科分會學術(shù)年會論文匯編[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 記者 李晶晶;海南成功培育猴類精原干細胞[N];�？谕韴�;2013年

2 高原;吸煙可破壞精原干細胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

3 ;美成功用鼠精原干細胞培育出幼鼠[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

4 劉海英;美科學家發(fā)現(xiàn)精原干細胞有望替代醫(yī)用胚胎干細胞[N];科技日報;2009年

5 高原;吸煙損害精子質(zhì)量[N];人民日報;2007年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 薩初拉;牛精原干細胞分離純化及長期培養(yǎng)研究[D];內(nèi)蒙古大學;2013年

2 王菊花;山羊精原干細胞體外增殖及其分化的調(diào)控[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2014年

3 趙會敏;巴馬小型豬精原干細胞相關(guān)問題的研究[D];廣西大學;2014年

4 阿拉達爾;山羊精原干細胞體外培養(yǎng)體系的建立與移植研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2007年

5 羅小敏;小鼠精原干細胞體內(nèi)增殖和分化階段睪丸組織基因的差異表達[D];武漢大學;2010年

6 張巖;大鼠精原干細胞的長期培養(yǎng)、鑒定及其特異標記基因表達載體的構(gòu)建[D];內(nèi)蒙古大學;2011年

7 劉陶迪;大鼠青春期前期精原干細胞自我更新和分化相關(guān)基因表達的初步研究[D];內(nèi)蒙古大學;2012年

8 張學明;小鼠精原干細胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化及體外基因轉(zhuǎn)移[D];吉林大學;2005年

9 李恩中;精原干細胞的體外培養(yǎng)及自增殖相關(guān)因子的篩選與初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2007年

10 張世慶;精原干細胞自增殖分子機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2007年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 凡志國;小鼠精原干細胞體外培養(yǎng)與冷凍技術(shù)研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2011年

2 穆海龍;PLZF通過靶向抑制miR-146a促進CXCR4表達調(diào)控奶山羊精原干細胞增殖[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

3 蔡桓;牛精原干細胞的分離培養(yǎng)和組蛋白H3K9三甲基化修飾研究[D];吉林大學;2016年

4 吳崇洋;白藜蘆醇對小鼠精原干細胞生物學特性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

5 牛博文;褪黑素通過刺激支持細胞分泌GDNF促進奶山羊精原干細胞的增殖[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

6 姬敏;小鼠睪丸3D培養(yǎng)體系的建立與成年小鼠精原干細胞富集方法的研究[D];內(nèi)蒙古大學;2016年

7 王麗莉;基因轉(zhuǎn)染精原干細胞在受體微環(huán)境中的增殖與分化[D];首都師范大學;2008年

8 丁曉麟;小鼠精原干細胞分離、純化、冷凍、培養(yǎng)、移植及其體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2008年

9 邢柳;小鼠精原干細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)與移植的初步研究[D];中南大學;2010年

10 宋銳;小鼠精原干細胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2010年

，

本文編號：1075375