發(fā)布時(shí)間：2017-10-17 07:37

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)蛋白1（PRC1）的表達(dá)對(duì)前列腺癌臨床進(jìn)展及預(yù)后的預(yù)測(cè)意義

  更多相關(guān)文章： 前列腺癌 PRC1 臨床病理特征 生化復(fù)發(fā) 預(yù)后

【摘要】：研究背景和目的：作為歐美等西方國(guó)家最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,前列腺癌的致死率在男性腫瘤中高居第二位,每年在全世界范圍內(nèi)有超過(guò)90萬(wàn)人被診斷為新發(fā)的前列腺癌。在2015年,美國(guó)前列腺癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)到220800例,占男性惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的26%,高居第一位,死亡病例數(shù)為27540例,占男性惡性腫瘤死亡人數(shù)的9%,是美國(guó)男性惡性腫瘤第二大死因。相對(duì)于歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家來(lái)說(shuō),中國(guó)前列腺癌發(fā)病率較低,但近年來(lái)隨著生活條件的改善、飲食結(jié)構(gòu)的改變、人口的老齡化進(jìn)程的加快,我國(guó)前列腺癌發(fā)病率、死亡率均有明顯提升,據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì),上海1997-1999年前列腺癌的發(fā)病率較1985-1987年增加了3.5倍。隨著診斷和治療技術(shù)的發(fā)展,大部分前列腺癌患者在早期就接受了根治手術(shù)或者去勢(shì)治療,治療延長(zhǎng)了生命,但是在這些患者中,術(shù)后約有20%-50%出現(xiàn)了生化復(fù)發(fā)(BCR Biochemical recurrence),而補(bǔ)救性治療(放療、化療、冷凍、消融)的效果均不理想。在現(xiàn)今的前列腺癌預(yù)后相關(guān)指標(biāo)的研究方面,PSA、Gleason、 TMN分期、激素受體、切緣陽(yáng)性等指標(biāo)已經(jīng)被用于預(yù)測(cè)術(shù)后前列腺癌的生物學(xué)行為。上述指標(biāo)提高了人們對(duì)前列腺癌根預(yù)后的預(yù)見(jiàn)性,可惜這些指標(biāo)無(wú)論是單獨(dú)還是聯(lián)合都不能準(zhǔn)確地診斷復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。所以在腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域?qū)ふ腋�、更特異的、有助于預(yù)測(cè)前列腺癌預(yù)后的病理或生化指標(biāo)就顯得尤為迫切了。在前列腺癌分子生物學(xué)研究領(lǐng)域尤其是基因組學(xué)領(lǐng)域中,近年來(lái)經(jīng)過(guò)多位學(xué)者的努力,一批與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切的基因逐漸涌現(xiàn)出來(lái),其中多個(gè)與細(xì)胞周期(Cell cycle progression, CCP)相關(guān)的基因被證實(shí)與前列腺癌術(shù)后的預(yù)后相關(guān),而且其中31個(gè)CCP基因已經(jīng)被挑選出來(lái)構(gòu)建成CCP評(píng)分模型并用于預(yù)測(cè)根治術(shù)后前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,這個(gè)模型的有效性已經(jīng)得到證實(shí)。細(xì)胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(Protein regulator of cytokinesis 1 PRC1)是31個(gè)CCP基因之一,該基因主要在G2/M期表達(dá),但是當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1期或退出有絲分裂后PRC1蛋白表達(dá)明顯就會(huì)下降。既往研究表明PRC1直接受抑癌基因P53的負(fù)性調(diào)控,而且在乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等腫瘤的研究中PRC1都被作為惡性增殖標(biāo)志和治療的靶標(biāo),但是PRC1與前列腺癌預(yù)后的研究尚無(wú)報(bào)道。在本研究中,我們首先通過(guò)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)了解PRC1在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的角色,隨后在前列腺癌細(xì)胞株中用QPCR及Western blot的方法證明PRC1在mRNA及蛋白水平表達(dá)上調(diào)。接下來(lái)在前列腺癌組織芯片中利用免疫組化的方法分析癌組織和非癌組織中PRC1的表達(dá)的差異,進(jìn)一步在基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)—Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI GEO accession:GSE21032)中分析mRNA水平該基因在癌組織和非癌組織的表達(dá)情況,綜合分析了RC1與前列腺癌病理特征之間的相關(guān)性。最終聯(lián)合目前常用的臨床指標(biāo)如PSA、Gleason評(píng)分等構(gòu)建前列腺癌的預(yù)測(cè)模型,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上說(shuō)明了PRC1與前列腺癌進(jìn)展、預(yù)后尤其是生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)材料為了挑選與前列腺癌進(jìn)展密切相關(guān)的基因,我們?cè)赥aylor數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI GEO accession no:GSE21032;該數(shù)據(jù)庫(kù)包括179例臨床樣本和細(xì)胞株相應(yīng)的microRNA及mRNA的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù))對(duì)31個(gè)與前列腺癌根治術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)的CCP基因進(jìn)行篩選,進(jìn)一步分析相關(guān)文獻(xiàn)挑選出本研究的目的基因PRC1。同時(shí)整理了Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺原位癌(150例)和前列腺癌旁組織(29例)的臨床病理、術(shù)后隨訪等信息,用于統(tǒng)計(jì)分析。本研究使用的細(xì)胞株(PC3、Lncap、BPH-1)購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞株mRNA提取試劑(Invitrogen,Madison,USA)、PRC1基因逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自(TakaraBiotechnology),蛋白提取試劑、Western blot實(shí)驗(yàn)試劑購(gòu)自于sigamao免疫組織化學(xué)分析使用的組織芯片購(gòu)自于上海(Shanghai Outdo Biotech Co,LTD(Cat No:HPro-Adel 80PG-01))該芯片包含99例前列腺原位癌組織及81例前列腺癌旁組織,每一例標(biāo)本都附帶該患者相應(yīng)的臨床信息,且所有患者術(shù)前均沒(méi)有接受過(guò)化療及放療。實(shí)驗(yàn)方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)：前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3及LNCAP、前列腺增生細(xì)胞BPH都購(gòu)自ATCC,細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%的雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)至37℃,5%的二氧化碳。2. 實(shí)時(shí)定量PCR (QPCR):按照試劑盒步驟從前列腺增生細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中提取總RNA,取2ug總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用20ul體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量,QPCR使用RotorGene 2000 system(Corbett Research,Mortlake,Australia)進(jìn)行,數(shù)據(jù)分析使用Rotor-Gene v5.0(Corbett Research),操作方法參照儀器所附帶的實(shí)驗(yàn)方案。3. Western blot:從前列腺增生細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中提取蛋白,取2ug蛋白在SDSPAGE膠電泳并轉(zhuǎn)移至雜交硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉溶于TBST封閉1小時(shí),隨后將膜洗干凈,按照1：2000的比例稀釋PRC1抗體(rabbit monoclonal antibody,ab51248,Abcam Co Ltd.,USA)及β-actin抗體(sc-47778,Santa Cruz,USA),整夜孵育,使用SuperSignal West PICO的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)觀察結(jié)果,選擇β-actin作為內(nèi)參蛋白。4. 免疫組化分析：10%中性福爾馬林保存臨床樣本后進(jìn)行石蠟包埋,組織被切成厚度為4um的切片,隨后二甲苯脫去石蠟、水化(DAKO EnVision System (Dako Diagnostics, Switzerland).蛋白酶消化并阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,按1：200的比例稀釋一抗體((rabbit monoclonal antibody, ab51248, Abcam Co Ltd., USA),4℃冰箱中整夜孵育一抗。第二日洗凈切片,使用辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的多聚物進(jìn)行標(biāo)記、色原體基質(zhì)處理發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的染色情況,實(shí)驗(yàn)中空白對(duì)照不加一抗處理。在蘇木素復(fù)染后,由兩位病理醫(yī)生獨(dú)立地對(duì)組織的免疫染色情況進(jìn)行評(píng)分,這兩位醫(yī)師不知道患者的診斷及預(yù)后。隨后對(duì)兩組評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行比較,任何標(biāo)本的評(píng)分出現(xiàn)差異都要重新評(píng)估,直到兩位病理醫(yī)師的評(píng)分達(dá)到一致時(shí),免疫染色評(píng)分才算完成。具體評(píng)分方法如下：(在顯微鏡下取十個(gè)典型的視野并數(shù)出陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù),計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞比例,根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū),細(xì)胞質(zhì)染色即為陽(yáng)性。根據(jù)染色細(xì)胞的比例(0-100%)及染色的深度(0-陰性、1-弱陽(yáng)性、2-中等陽(yáng)性、3-強(qiáng)陽(yáng)性來(lái)評(píng)定每一個(gè)腫瘤組織切片目的蛋白表達(dá)水平。染色細(xì)胞比例評(píng)分及染色深度評(píng)分相加構(gòu)成了最終的免疫組化評(píng)分(immunoreactivity score, IRS) 。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包(SPSS Inc,IL,USA)處理。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)果用表示,所有2×2表格進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn),對(duì)非2×2進(jìn)行Pearson卡方檢驗(yàn),使用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析,Cox危險(xiǎn)因素回歸模型用于分析單因素和多因素的生存分析,當(dāng)P值小于0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：a. 從CCP基因群中挑選出PRCl我們?cè)赥aylor數(shù)據(jù)庫(kù)中用Kaplan-Meier plots分析了這31個(gè)CCP基因與前列腺癌生存率以及生化復(fù)發(fā)率的關(guān)系,結(jié)果顯示其中10個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因和生化復(fù)發(fā)相關(guān)。在這個(gè)列表包含的基因中,既往研究表明PRC1可能是為惡性腫瘤細(xì)胞增殖的指標(biāo)。同時(shí)多項(xiàng)研究也報(bào)道了該基因與人類(lèi)多種癌癥的不良預(yù)后密切相關(guān),故選擇PRC1作為目的基因進(jìn)行研究。b.PRC1在前列腺癌細(xì)胞株表達(dá)上調(diào)。QPCR及Westernblot在mRNA水平、蛋白水平證實(shí)：與前列腺良性增生細(xì)胞(BPH-1)相比,前列腺癌細(xì)胞中PRC1基因在mRNA、蛋白水平都呈現(xiàn)出表達(dá)上調(diào)(P0.05)。c.PRC1蛋白在前列腺癌臨床標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)前列腺癌組織芯片的免疫組化結(jié)果提示PRC1蛋白主要表達(dá)部位在癌組織的胞質(zhì),在癌旁組織不表達(dá)或只是中等表達(dá),并且PRC1蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于非癌組織。(免疫組化評(píng)分(IRS)：IRS:PCa=5.56±1.624vs.Benign=4.65±1.352,P0.001d. PRC1的mRNA表達(dá)量與前列腺癌臨床病理特征相關(guān)臨床芯片免疫組化證實(shí)PRC1蛋白表達(dá)上調(diào),而在Taylor基因芯片中,PRC1在前列腺癌組織中的mRNA表達(dá)量也明顯高于非癌組織(PCa=6.8734±0.3802 vs. Benign=6.6129±0.1239, P0.001)。更有意義的是,PRC1的表達(dá)量增加與高Gleason評(píng)分(P=0.041),腫瘤轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)(P0.006),生化復(fù)發(fā)(P0.013)都密切相關(guān),這些信息都表明PRC1和前列腺癌的臨床預(yù)后存在緊密的聯(lián)系。e.分析PRC1的mRNA表達(dá)量有助于預(yù)測(cè)前列腺癌的預(yù)后我們使用Kaplan-Meier在Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了PRC1基因表達(dá)量與前列腺癌患者總體生存率、生化復(fù)發(fā)率之間的聯(lián)系。以PRC1表達(dá)量的中位數(shù)為分割點(diǎn)將前列腺癌組織分為高表達(dá)組(75例)和低表達(dá)組(75例)。對(duì)于預(yù)測(cè)前列腺癌總體生存率,PRC1高表達(dá)組和低表達(dá)組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在生化復(fù)發(fā)的研究中,高表達(dá)組明顯更早地出現(xiàn)了生化復(fù)發(fā)。在COX回歸分析中,單因素分析中高表達(dá)組與低表達(dá)組在生化復(fù)發(fā)時(shí)間上也表現(xiàn)出明顯差異(HR 5.08, 95% CI 2.51-10.26; P0.001)=此外,在多因素分析結(jié)果中,表達(dá)上調(diào)的PRC1 (HR 6.23,95% CI 2.08-19.06; P=0.001)、高Gleason評(píng)分(HR 2.70,95% CI 1.69-4.33; P＜0.001、術(shù)前高PSA水平(HR 1.01,95% CI 1.00-1.01; P=0.02)都是生化復(fù)發(fā)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。結(jié)論：1.PRC1在前列腺癌細(xì)胞及癌組織中表達(dá)均上調(diào),其在mRNA及蛋白質(zhì)水平的上調(diào)表達(dá)有助于鑒別前列腺癌及前列腺良性組織。2.PRC1的表達(dá)上調(diào)與前列腺癌的多項(xiàng)病理特征相關(guān),臨床檢測(cè)PRC1的表達(dá)量可以有協(xié)助預(yù)測(cè)前列腺癌的預(yù)后。3.前列腺癌患者PRC1的表達(dá)與前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)相關(guān),評(píng)估PRC1的表達(dá)有助于預(yù)測(cè)前列腺癌術(shù)后生化復(fù)發(fā),可以協(xié)助臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 PRC1 臨床病理特征 生化復(fù)發(fā) 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 前言17-40
• 1.1 前列腺的解剖結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2 前列腺癌的流行病學(xué)概述18-21
• 1.3 前列腺癌分子生物學(xué)研究概述21-23
• 1.4 前列腺癌進(jìn)展相關(guān)分子生物學(xué)變化23-24
• 1.5 前列腺癌診斷24-29
• 1.6 前列腺癌治療29-31
• 1.7 前列腺癌生化復(fù)發(fā)(BIOCHEMICAL RECURRENCE)31-33
• 1.8 細(xì)胞周期進(jìn)展基因與腫瘤預(yù)后(CELL CYCLE PROGRESSION SCORE)33-36
• 1.9 PRC1基因概述36-38
• 1.10 本研究擬解決的問(wèn)題38-40
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法40-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料40-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑44
• 2.3 實(shí)驗(yàn)主要溶液配制44-46
• 2.4 實(shí)驗(yàn)儀器46-47
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法47-54
• 2.6 前列腺癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(TAYLOR數(shù)據(jù)庫(kù))54-55
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理55-56
• 第三章 結(jié)果56-63
• 3.1 從CCP基因群中挑選出PRC156
• 3.2 PRC1的MRNA在前列腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)56-57
• 3.3 前列腺癌細(xì)胞株中PRC1蛋白表達(dá)量升高57-58
• 3.4 PRC1蛋白在前列腺癌臨床標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)58-60
• 3.5 PRC1的MRNA表達(dá)量與前列腺癌臨床病理特征之間聯(lián)系60-61
• 3.6 PRC1表達(dá)量對(duì)于前列腺診斷價(jià)值的描述61-63
• 第四章 討論63-66
• 4.1 PRC1與前列腺癌發(fā)生相關(guān)63
• 4.2 PRC1與前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)63-64
• 4.3 前列腺癌中PRC1可能的調(diào)控機(jī)制64-66
• 第五章 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-76
• 本研究的不足之處76-77
• 縮略詞表77-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文80-81
• 致謝81-83

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 羅宏偉;細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)蛋白1（PRC1）的表達(dá)對(duì)前列腺癌臨床進(jìn)展及預(yù)后的預(yù)測(cè)意義[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1047598