本文關鍵詞：腦外傷后Nrf2-ARE通路對泛素—蛋白酶體系統(tǒng)的作用及機制研究

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【摘要】：第一部分題目：小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用研究背景：創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是現(xiàn)代社會中引起腦部損害的主要原因,具有高致死率,高致殘率的特點,給人類的生命健康帶來了嚴重的威脅。TBI后神經(jīng)元的損傷機制主要分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,原發(fā)性損傷是外力作用時即造成的損傷,如挫裂傷、彌漫性軸突損傷等,人為干預無法改變其結(jié)果;繼發(fā)性損傷是受傷之后逐漸出現(xiàn)的,目前發(fā)現(xiàn)的病理過程包括線粒體功能損傷、細胞凋亡、氧化應激、鈣超載、神經(jīng)毒性等,積極的處理和預防這些繼發(fā)性損傷是腦外傷臨床治療的基本原則和意義所在。對于繼發(fā)性腦損傷,目前尚無確實有效的治療方法,原因在于繼發(fā)性腦損傷的機制尚不明確,因此對TBI后繼發(fā)性損傷機制的研究始終是國內(nèi)外研究的熱點,而從錯綜復雜的發(fā)生機制中找出關鍵病理通路和信號轉(zhuǎn)導的核心因子是尋找有效的治療手段的重中之重。核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)是近年來研究比較熱門的一個保護因子。生理狀態(tài)下,Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子(Kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)結(jié)合,并被Keap1傳遞至泛素—蛋白酶體系統(tǒng)進行降解,活性處于相對抑制狀態(tài)。在創(chuàng)傷、感染等應激狀態(tài)或者化學物質(zhì)如tBHQ,萊菔硫烷的刺激下,Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變相,Nrf2與Keap1解偶聯(lián),Nrf2隨即進入細胞核,與抗氧化反應元件(Antioxidant response element, ARE)結(jié)合,啟動ARE調(diào)控的保護性因子的表達,提高細胞對各種刺激的抵抗力。研究表明,該通路激活后可以有效表達Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、抗炎癥蛋白等下游分子,而這些分子恰恰涵蓋了TBI后多種繼發(fā)性損傷等防御性機制,如抗氧化應激、減輕炎癥損傷、抗細胞凋亡等,從多個方面起到神經(jīng)保護作用。泛素—蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)作為體內(nèi)特異性的蛋白降解途徑,以其在維持細胞及蛋白質(zhì)正常功能方面的重要作用越來越受到人們重視,研究發(fā)現(xiàn)泛素—蛋白酶體系統(tǒng)受損傷后會導致異常泛素化蛋白聚集,引起細胞功能障礙甚至死亡。在阿爾茨默、帕金森、亨廷頓病等許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都已經(jīng)檢測到了大量泛素化蛋白的異常聚集。在顱腦外傷中有學者研究發(fā)現(xiàn)腦組織中泛素—蛋白酶體系統(tǒng)受損后導致大量異常的泛素化蛋白聚集,損害腦功能,導致神經(jīng)功能的障礙：而我們在前期研究也發(fā)現(xiàn)外傷后人腦脊液及挫傷組織中有迅速而明顯的泛素化水平的增加。這些結(jié)果均表明泛素—蛋白酶體系統(tǒng)是神經(jīng)系統(tǒng)中響應損傷的一種早期反應,在TBI后繼發(fā)性神經(jīng)損傷發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用,因此,對TBI后蛋白降解途徑的研究具有重要意義。研究表明Nrf2的胞漿伴侶分子Keap1實質(zhì)上是一種泛素—蛋白連接酶E3,Keap1與Nrf2的相互作用構(gòu)成了Nrf2信號通路的調(diào)控中心。在PC12細胞系中,使用針對UPS通路的抑制劑乳胞素預處理后,可以增強氯化錳誘導的Nrf2活化,與DNA上ARE序列結(jié)合,上調(diào)一系列保護性因子的表達。這些研究結(jié)果提示,Nrf2與UPS系統(tǒng)之間存在密切聯(lián)系。然而UPS在顱腦創(chuàng)傷中受何種因素調(diào)控,又作用于哪些蛋白或基因尚不清楚,本研究將對此進行探討。目的：本實驗主要目的為檢測TBI后Nrf2和UPS的表達,并進一步觀察在使用UPS抑制劑MG132后小鼠的預后,探討兩者之間可能的調(diào)控機制。方法：1.實驗動物及分組：使用健康成年雄性ICR小鼠,大小約28-32g;成年雄性Nrf2(-/-)小鼠,大小約28-32g;均有南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供。按隨機數(shù)字表法將雄性ICR小鼠隨即分為4組：對照組,外傷組,外傷+tBHQ組,外傷+MG132組；Nrf2(-/-)小鼠為外傷組,外傷+MG132組。每組動物均為12只。2.小鼠TBI模型的建立：采用改良的flierl自由落體法制備閉合性小鼠腦損傷模型。常規(guī)備皮消毒后將小鼠置于立體定向儀上,沿小鼠頭部中線位置切開約1 cm,重力撞擊點定位于左側(cè)大腦半球冠狀縫后3mm和矢狀縫左側(cè)3 mm的交叉點。對照組僅切開頭皮,外傷組使用200 g重物自2.5 cm高處自由落體垂直撞擊于定位點上。整個過程均在無菌條件下進行,并注意保持硬腦膜完整性。3.藥物的處理：tBHQ先配制成濃度為5mg/ml溶于1%DMSO中的溶液,按照50mg/kg計算劑量并于造模前一天經(jīng)腹腔注射給藥；MG132配制成濃度為3mg/ml溶于1%DMSO的溶液,按照20mg/kg計算劑量并于造模前6小時經(jīng)腹腔注射給藥。4.標本的取材和制備：致傷24小時后,將小鼠麻醉后,經(jīng)左心室灌注等滲鹽水(4℃)至肝臟發(fā)白后斷頭開顱取腦。將傷灶周圍1mm3的腦組織置于4%戊二醛中保存,用于電鏡檢測：將傷灶周圍3mm的腦組織置于-80℃冰箱保存,用于western blot檢測;再經(jīng)同樣途徑灌注4%多聚甲醛,之后開顱取腦,置于4%多聚甲醛中固定,然后石蠟包埋,切片,用于免疫組織化學檢測及TUNEL細胞凋亡檢測。5.神經(jīng)功能評分：在TBI后1天,3天采用NSS評分對小鼠進行神經(jīng)功能評分。所得分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴重。6.測定腦水腫：TBI后24小時,將動物處死,迅速取腦,去除腦干及小腦,獲得傷灶側(cè)皮層組織。測定每個樣品的濕重,然后在80℃烘箱中干燥72h,可獲得每個樣品的干重。用公式計算腦組織含水量：[(濕重—干重)／濕重]×100%。7.TUNEL細胞凋亡檢測：采用TUNEL細胞凋亡試劑盒對腦組織石蠟切片(5μm)進行神經(jīng)細胞凋亡對檢測。同樣在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨即選取6個視野對TUNEL陽性細胞進行計數(shù),求出平均值(以每100個細胞中TUNEL陽性細胞對個數(shù)來表示陽性),然后進行統(tǒng)計學分析。8.western blot檢測：分別利用12%,10%的凝膠電泳分離核蛋白,漿蛋白,檢測各組核蛋白,漿蛋白中Nrf2的表達；分別利用8%,15%凝膠電泳分離總蛋白,檢測總蛋白中泛素化蛋白及游離泛素的表達。9.免疫組化染色：制作組織切片,利用免疫組化染色方法檢測各組中Nrf2的表達,及Nrf2在細胞內(nèi)的定位情況。10.凝膠電泳遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA):采用EMSA試劑盒對小鼠腦皮層組織進行生物素標記的Nrf2目的DNA的檢測。11.乙醇磷鎢酸電鏡觀察泛素化蛋白：外傷模型后24小時,取各組小鼠的腦組織約1mm3,置于4%戊二醛溶液中固定1小時,再分別用30%,505,70%,90%和100%乙醇梯度脫水。新鮮配制乙醇磷鎢酸溶液,即10m1100%乙醇中加入O.1g磷鎢酸和4滴95%乙醇。乙醇磷鎢酸溶液中染色50分鐘,中途換液一次。干丙酮中進一步脫水后包埋在Durcupan ACM樹脂中,切成薄片后于透射電鏡下觀察蛋白質(zhì)聚集物。12.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±SEM)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：1.TBI后激活Nrf2表達可以改善神經(jīng)功能,減少腦水腫和抑制神經(jīng)細胞的凋亡。與單純外傷組相比,TBI后外傷+tBHQ組中核蛋白Nrf2明顯增高(P0.001),同時神經(jīng)功能評分NSS下降(P0.05),腦組織中水含量降低(P0.001),神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少(P0.001)。2.TBI激活Nrf2表達可減少異常的泛素化蛋白表達。與單純外傷組相比,TBI后外傷+tBHQ組泛素化蛋白減少(P0.05),相對的游離泛素增多(P0.05)。3.TBI后抑制Nrf2表達可加劇神經(jīng)功能障礙,增加腦水腫,促進神經(jīng)細胞的凋亡。與單純外傷組相比,Nrf2(-／-)小鼠在外傷后核蛋白中Nrf2表達明顯降低(P0.05),同時NSS神經(jīng)功能評分升高(P0.05),腦組織中水含量增多(P0.05),神經(jīng)元凋亡數(shù)目變多(P0.05)。4.TBI后抑制Nrf2表達可增加異常的泛素化蛋白的表達。與單純外傷組相比,Nrf2(-/-)小鼠在外傷后泛素化蛋白增多(P0.05),相對的游離泛素減少(P0.05)。5.在Nrf2(+／+)小鼠中使用MG132后可顯著增加泛素化蛋白的表達,并且明顯加劇神經(jīng)細胞的凋亡,而在Nrf2(-/-)小鼠中使用MG132后泛素化蛋白表達沒有明顯改變,并且不影響神經(jīng)細胞的凋亡水平。在Nrf2(+／+)小鼠中,給予MG132抑制UPS活性后(P0.01),外傷組比對照組中神經(jīng)元凋亡程度更嚴重(P0.001)；在Nrf2(-/-)小鼠中,給予MG132后泛素化蛋白表達沒有明顯改變(P0.05),且外傷組和對照組中神經(jīng)元凋亡水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論：1.TBI后激活Nrf2表達引起泛素化蛋白的減少,表明UPS活性增高；TBI后抑制Nrf2表達引起泛素化蛋白的增加,表明UPS活性下降。2.Nrf2可能通過調(diào)控UPS來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。第二部分題目：小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路調(diào)控泛素—蛋白酶體系統(tǒng)的可能機制研究背景：在第一部分實驗中,我們初步檢測了TBI后Nrf2和UPS的表達變化,發(fā)現(xiàn)UPS隨著Nrf2表達含量的增高而活性升高,隨著Nrf2表達含量的抑制而活性下降,并且在Nrf2基因敲除小鼠身上使用UPS抑制劑后UPS活性并無顯著改變。因此,我們有理由相信Nrf2可能通過調(diào)控UPS來最終發(fā)揮神經(jīng)保護作用,接下來我們將進一步探討其中可能的調(diào)控機制。有文獻研究顯示在使用蛋白酶抑制劑MG132后,可以觀察到還原型谷胱甘肽(GSH)含量減少,伴隨著高活性分子活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的增多；同時GSH作為Nrf2-ARE下游激活的一個因子,與Nrf2之間的關系十分緊密,文獻證實Nrf2-GSH通路的功能障礙直接影響Ⅱ型細胞的生長,增加對氧化劑的敏感性,從而損傷細胞。以上結(jié)果均表明,以GSH/ROS為代表的氧化還原平衡與Nrf2和UPS之間關系密切。目的：本實驗通過激活或抑制Nrf2表達來檢測GSH/ROS水平,同時通過激活或抑制GSH/ROS表達來檢測UPS活性的高低,探討Nrf2與UPS之間可能的調(diào)控機制。方法：1.實驗動物及分組：使用健康成年雄性ICR小鼠,大小約28-32g；成年雄性Nrf2(-/-)小鼠,大小約28-32g；均有南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供。按隨機數(shù)字表法將雄性ICR小鼠隨即分為4組：對照組,外傷組,外傷+tBHQ組,外傷+FAC組,外傷+NAC組；將Nrf2(-／-)小鼠分為外傷組。2.小鼠TBI模型的建立：采用改良的flierl自由落體法制備閉合性小鼠腦損傷模型。常規(guī)備皮消毒后將小鼠置于立體定向儀上,沿小鼠頭部中線位置切開約1 cm,重力撞擊點定位于左側(cè)大腦半球冠狀縫后3mm和矢狀縫左側(cè)3mm的交叉點。對照組僅切開頭皮,外傷組使用200 g重物自2.5 cm高處自由落體垂直撞擊于定位點上。整個過程均在無菌條件下進行,并注意保持硬腦膜完整性。3.藥物的處理：tBHQ先配制成濃度為5mg/ml溶于1%DMSO中的溶液,按照50mg/kg計算劑量并于造模前一天經(jīng)腹腔注射給藥；FAC先配制成濃度為1ug/ul溶于0.9%生理鹽水中,按照2.5ul／只劑量于造模前經(jīng)側(cè)腦室給藥；NAC先配制成濃度為30mg/mL溶于0.9%生理鹽水中,按照150mg/kg于TBI后5分鐘,6小時分兩次經(jīng)腹腔給藥。4.標本的取材和制備：致傷24小時后,將小鼠麻醉后,經(jīng)左心室灌注等滲鹽水(4℃)至肝臟發(fā)白后斷頭開顱取腦。將傷灶周圍3mm的腦組織置于-80℃冰箱保存,用于GSH, ROS及western blot檢測：經(jīng)同樣途徑灌注4%多聚甲醛,之后開顱取腦,置于4%多聚甲醛中固定,然后石蠟包埋,切片,用于免疫組織化學檢測；再經(jīng)同樣途徑灌注等滲鹽水(4℃)之后開顱取腦置于-800C冰箱保存,梯度蔗糖脫水后固定包埋冰凍切片,用于免疫熒光化學檢測。5.檢測腦組織中GSH和ROS含量：根據(jù)GSH和ROS檢測試劑盒說明書進行操作,使用酶標儀進行測量,用Bradford法測定總蛋白。GSH含量和ROS強度分別用umol/L, fluorescence intensity/mg.protein來表示。6.免疫熒光化學檢測：制備組織冰凍切片,利用免疫熒光雙染方法檢測腦組織中ROS的表達以及在神經(jīng)元細胞,細胞核中的分布情況。7.western blot檢測：利用8%凝膠電泳分離總蛋白,檢測總蛋白中泛素化蛋白的表達。8.免疫組織化學檢測：制作石蠟組織切片,利用免疫組化染色方法檢測泛素化蛋白的表達。9.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±SEM)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：1.TBI后使用tBHQ可以引起GSH含量增高,ROS表達強度下降。與單純外傷相比,TBI后使用tBHQ可以明顯增高GSH表達含量(P0.05),而且ROS表達強度明顯變?nèi)?P0.0001)。2.TBI后Nrf2(-／-)小鼠中GSH含量降低,ROS表達強度增高。與單純外傷組相比,TBI后Nrf2(-／-)小鼠中GSH表達含量明顯降低(P0.05),ROS表達強度明顯增高(P0.0001)。3.TBI后激活ROS表達強度后,GSH的含量顯著下降,泛素化蛋白表達明顯增多。與單純外傷組相比,使用FAC刺激ROS生成后(P0.0001),出現(xiàn)GSH含量的下降(P0.05),和泛素化蛋白的增多(P0.01)。4.TBI后抑制ROS表達強度后,GSH的含量,泛素化蛋白的表達明顯減少。與單純外傷組相比,使用NAC抑制ROS生成后(P0.0001),出現(xiàn)GSH含量的升高(P0.05),和泛素化蛋白的減少(P0.05)。結(jié)論：1.TBI后激活表達Nrf2,可以增加GSH含量,同時減少ROS表達強度；TBI后抑制表達Nrf2,可以明顯減少GSH含量,同時顯著增強ROS表達強度。2.TBI后激活表達ROS,可以使GSH的含量顯著下降,泛素化蛋白表達明顯增多,UPS活性下降；TBI后抑制表達ROS,可以使GSH的含量顯著增高,泛素化蛋白表達明顯減少,UPS活性增高。3.Nrf2通過氧化還原平衡(GSH/ROS)來調(diào)控UPS的活性。第三部分題目：神經(jīng)元TBI模型中Nrf2-ARE通路對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的作用研究背景：在以上實驗中,我們初步在小鼠腦外傷模型中探討來Nrf2可能是通過調(diào)節(jié)氧化還原平衡反應進而影響UPS活性來起到神經(jīng)保護作用。但是在體外環(huán)境中這條通路是否存在,還有待于進一步驗證。目的：在體外環(huán)境中驗證Nrf2,氧化還原平衡,UPS三者之間的關系。方法：1.神經(jīng)元的培養(yǎng)：選取孕17-19天的成年雌性ICR及Nrf2(-/-)小鼠,斷頸處死后,放入酒精中消毒。剪開腹部暴露子宮,分離胎囊。顯微操作小心去除腦干,將剩余腦皮層中軟腦膜,血管膜逐一清除后進行神經(jīng)元的消化,并種板至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)7天至神經(jīng)元成熟后再行后續(xù)實驗。2.神經(jīng)元的分組及外傷模型：培養(yǎng)成熟后的ICR神經(jīng)元隨即分為：對照組,外傷組,外傷+tBHQ組,外傷+FAC組,外傷+NAC組；培養(yǎng)成熟后的Nrf2(-/-)神經(jīng)元分為外傷+敲除組；神經(jīng)元TBI模型采用經(jīng)典的劃傷模型,即使用lul槍頭在六孔板中按照每隔4mm間隔劃線,每個孔中約劃9x9個小格子,即為神經(jīng)元的外傷模型。3.藥物的處理：用培養(yǎng)基配制tBHQ至最終濃度為10uM,于TBI前2小時加入六孔板中,每孔加入2ml；用培養(yǎng)基配制FAC至最終濃度為200uM,于TBI前4小時加入六孔板中,每孔加入2m1；用培養(yǎng)基配制NAC至最終濃度為200uM,于TBI后6小時加入六孔板中,每孔加入2ml。4. western blot檢測：分別利用12%,10%的凝膠電泳分離核蛋白,漿蛋白,檢測各組核蛋白,漿蛋白中Nrf2的表達；分別利用8%凝膠電泳分離總蛋白,檢測總蛋白中泛素化蛋白的表達。5.實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)：按照試劑盒說明,進行目標基因Nrf2的qPCR檢測。6.活性氧(reactive oxygen species, ROS)的熒光檢測：按照試劑盒說明進行操作,先原位裝載探針,孵育20分鐘后清洗3遍,一部分進行熒光顯微鏡的觀察,一部分進行流氏細胞儀檢測測定熒光強度,使用488nm激發(fā)波長,525nm發(fā)射波長,實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。7.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±SEM)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：1.神經(jīng)元TBI模型后激活Nrf2的表達可以有效促進Nrf2的核轉(zhuǎn)移,同時減弱ROS的表達。使用tBHQ激活Nrf2的表達,與單純外傷組相比發(fā)現(xiàn)TBI后Nrf2的核轉(zhuǎn)移增加(P0.05),同時ROS的熒光強度變?nèi)?P0.001)。2.神經(jīng)元TBI模型后抑制Nrf2的表達可以有限降低Nrf2的核轉(zhuǎn)移,同時ROS的表達增強。使用Nrf2(-／-)孕鼠培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元中Nrf2含量顯著降低(P0.05),與單純外傷組相比TBI后Nrf2核轉(zhuǎn)移減少(P0.001),同時ROS的表達強度明顯增強(P0.01)。3.神經(jīng)元TBI模型后激活ROS的表達可以增加泛素化蛋白的表達。與單純外傷組相比,使用FAC可以顯著激活ROS的表達(P0.01),同時發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白增多(P0.01)。4.神經(jīng)元TBI模型后抑制ROS的表達可以減少泛素化蛋白的表達。與單純外傷組相比,使用NAC可以顯著抑制ROS的表達(P0.001),同時發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白減少(P0.05)。結(jié)論：1.神經(jīng)元TBI模型中激活Nr2表達可以減少ROS的表達；抑制Nr2的表達可以增加ROS的表達。2.神經(jīng)元TBI模型中激活ROS表達可以降低UPS的活性；神經(jīng)元TBI模型中抑制ROS表達可以增加UPS的活性。
【關鍵詞】：創(chuàng)傷性腦損傷 Nrf2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng) Nrf2 氧化還原平衡 泛素-蛋白酶體系統(tǒng) 神經(jīng)元體外培養(yǎng) Nrf2 ROS UPS
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 摘要3-16
• ABSTRACT16-36
• 第一部分 小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的可能作用36-62
• 1. 背景36-39
• 2. 材料與方法39-49
• 3. 實驗結(jié)果49-59
• 4. 討論59-62
• 第二部分 小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路調(diào)控泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的可能機制62-73
• 1. 背景62-63
• 2. 材料與方法63-67
• 3. 實驗結(jié)果67-71
• 4. 討論71-73
• 第三部分 體外腦外傷模型中Nrf2-ARE通路調(diào)控泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的可能機制73-85
• 1. 背景73
• 2. 材料與方法73-78
• 3. 實驗結(jié)果78-84
• 4. 討論84-85
• 參考文獻85-91
• 英文縮略詞表91-92
• 攻讀學位期間成果92-93
• 致謝93-96

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本文編號：907838