本文關(guān)鍵詞：拮抗高遷移率族蛋白B1對(duì)燙傷小鼠白介素-35表達(dá)及T細(xì)胞免疫功能的影響

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【摘要】：研究背景與目的嚴(yán)重?zé)齻笠壮霈F(xiàn)免疫功能紊亂,既往研究證實(shí)高遷移率族蛋白B1及白介素35在多原因?qū)е碌拿庖吖δ芪蓙y發(fā)病機(jī)制中起重要作用。高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)是燒傷后重要的晚期炎癥介質(zhì)和經(jīng)典的損傷相關(guān)分子(DAMPs)。HMGB1一方面參與炎性細(xì)胞的聚集和組織的修復(fù),另一方面也能激活免疫功能細(xì)胞分泌TNF、IL-1和其它促炎因子,并引起血管通透性增加、發(fā)熱等病理生理反應(yīng)。此外HMGB1還能促使T細(xì)胞亞群分化由Th1向Th2漂移,并可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)表面分子的成熟。既往研究發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重?zé)齻笾饕M織HMGB1表達(dá)廣泛、增高較晚,且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。臨床資料顯示,嚴(yán)重?zé)齻?天患者血漿HMGB1含量明顯升高,并且其水平與嚴(yán)重膿毒癥病理過(guò)程密切相關(guān)。因此HMGB1在燒創(chuàng)傷、感染、膿毒癥等病理生理過(guò)程中扮演著重要角色,被認(rèn)為是燒創(chuàng)傷引起膿毒癥的潛在治療靶點(diǎn)。嚴(yán)重燙傷動(dòng)物血清中的HMGB1表達(dá)水平升高,與脾臟Treg表面標(biāo)志分子表達(dá)上調(diào)、免疫抑制功能增強(qiáng)有關(guān)。白介素35(IL-35)作為與Treg免疫抑制功能密切相關(guān)的新型細(xì)胞因子,在Treg的分化和發(fā)育中都不可或缺。IL-35由IL.12 α(即p35)和EB13兩個(gè)亞基構(gòu)成,在Treg的亞群(iTr35)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)、CD8陽(yáng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD8+Tregs)、髓源性免疫抑制細(xì)胞(MDSC)等免疫細(xì)胞表達(dá)。Treg可通過(guò)IL-35調(diào)控Th1、Th2和Th17等效應(yīng)T細(xì)胞的分化,如IL-35可將T細(xì)胞中Thl細(xì)胞周期阻滯于G1期以抑制Thl增殖,或可通過(guò)抑制Th17表面受體表達(dá),抑制Th17功能,從而相對(duì)增強(qiáng)Th2的功能。嚴(yán)重燙傷后HMGB1是否會(huì)影響效應(yīng)細(xì)胞對(duì)IL-35的表達(dá),繼而影響T淋巴細(xì)胞分化及免疫功能,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠燙傷模型。采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(Q-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)等動(dòng)態(tài)檢測(cè)了小鼠燙傷后72 h內(nèi)其心、肝、脾、肺組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1和IL-35的表達(dá)以及脾臟淋巴細(xì)胞功能的變化。通過(guò)腹腔注射HMGB1的特異性拮抗劑Abox拮抗小鼠體內(nèi)HMGB1的主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放,進(jìn)一步檢測(cè)此條件下,實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)各臟器組織IL-35表達(dá)變化及脾臟淋巴細(xì)胞功能的改變。試圖了解小鼠燙傷后HMGB1對(duì)其臟器組織IL-35的表達(dá)及脾臟淋巴細(xì)胞功能變化的影響,為改善嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體免疫抑制狀態(tài)提供新的思路。目的觀察小鼠燙傷后心、肝、脾、肺組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1和IL-35的表達(dá)變化,并探討HMGB1對(duì)臟器組織細(xì)胞表達(dá)IL-35及脾臟T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。方法選擇成年、雄性BALB/c小鼠,稱(chēng)重后隨機(jī)分為：空白組、假傷組、燙傷組、Abox干預(yù)組。乙醚吸入性麻醉后常規(guī)制作小鼠背部15%TBSA燙傷模型。燙傷組和干預(yù)組小鼠燙傷后0、12 h給予補(bǔ)液抗休克。干預(yù)組燙傷后2 h和12 h分別給予HMGB1特異性拮抗劑Abox腹腔注射(300 μg/只)。于傷后24、48、72 h取材,留取心、肝、脾、肺等組織,組織勻漿后,分別提取RNA和組織總蛋白；qPCR法測(cè)定IL-35亞基p35和EBI3 mRNA表達(dá),ELISA法測(cè)定各組織、脾臟單個(gè)核細(xì)胞中HMGB1和IL-35蛋白表達(dá)。另將脾臟組織分離出脾臟單個(gè)核細(xì)胞,并用貼壁法分離部分脾臟單個(gè)核細(xì)胞中的T細(xì)胞,cck8法檢測(cè)T細(xì)胞增殖活性；并取T細(xì)胞上清測(cè)定IL-2、IFN-γ、IL-4含量。使用SPSS16.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示；資料滿足正態(tài)分布時(shí),采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1小鼠燙傷后臟器組織HMGB1及IL-35表達(dá)變化正常小鼠(空白組)心、肝、脾、肺組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞HMGB1蛋白和IL-35亞基(P35及EBI3) mRNA和蛋白表達(dá)均有表達(dá)。與空白組比較,假傷組肝、脾、肺組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)無(wú)差異(P0.05),而假傷組心臟組織HMGB1蛋白表達(dá)高于空白組(P0.05)；假傷組心、肝、脾組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞于48 h內(nèi)P35及EBI3 mRNA水平高于空白組(P0.05),肺組織P35及EBI3 mRNA無(wú)明顯差異(P0.05)；假傷組肝、脾、肺組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞于72內(nèi)IL-35蛋白表達(dá)與空白組無(wú)差異,心臟組織IL-35蛋白表達(dá)高于空白組(P0.05)。與空白組與假傷組比較,燙傷組傷后24、48、72 h小鼠心、肝、脾臟組織中HMGB1蛋白、P35、EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明顯升高(P0.01),而肺臟組織中P35、EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明顯下降。2 Abox干預(yù)對(duì)燙傷小鼠組織HMGB1表達(dá)的影響與假傷組與空白組比較,燙傷組各臟器HMGB1表達(dá)在燙傷后24h顯著上升(P0.01),并在24-48h維持在高水平,燙傷72h后逐漸下降。與燙傷組比較,Abox干預(yù)組傷后24、48 h小鼠心、肝、脾、肺組織HMGB1含量及脾臟單個(gè)核細(xì)胞HMGB1表達(dá)均明顯下降(P0.01)。3 Abox干預(yù)對(duì)燙傷小鼠體內(nèi)IL-35表達(dá)水平的影響3.1 IL-35 mRNA表達(dá)：與假傷組比較,燙傷組小鼠各臟器IL-35亞基p35mRNA表達(dá)均明顯提高。其中以脾臟變化最明顯,肺臟變化最小,在傷后48h、72h,肺臟p35mRNA表達(dá)水平與假傷組無(wú)差異。亞基EBI3 mRNA表達(dá)水平均升高(P0.05)以肝臟變化最大,肺臟變化最小,在傷后48h與72h組,肺臟EBI3mRNA表達(dá)水平與假傷組無(wú)差異。使用Abox干預(yù)后24h,燙傷小鼠各臟器中IL-35兩亞基的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P0.01)。干預(yù)后48h,肺臟兩亞基mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2 IL-35蛋白水平變化：與假傷組比較,燙傷后24h心臟、肝臟、脾臟組織中IL-35蛋白含量及脾臟單個(gè)核細(xì)胞IL-35的分泌量均較假傷組升高(P0.01),以脾臟變化最大。而燙傷后24h肺組織IL-35蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降(P0.01)。Abox干預(yù)后小鼠心臟、肝臟、脾臟組織和脾臟單個(gè)核細(xì)胞IL-35蛋白水平均明顯下降(P0.01)。肺組織IL-35變化趨勢(shì)與其它組織相反,Abox干預(yù)后其含量明顯上升。4 Abox干預(yù)對(duì)燙傷小鼠脾臟T細(xì)胞免疫功能的影響4.1 IFN-y及IL-4分泌水平：與假傷組比較,燙傷組T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ及IL-4含量于傷后24、48 h明顯升高(P0.01),72 h降低至假傷組水平(P0.05)。與燙傷組比較,Abox干預(yù)后,傷后24、48h IFN-γ更明顯升高,IL-4明顯降低,因此Abox干預(yù)組IFN-γ/IL-4比值較燙傷組明顯升高(P0.01)。4.2 T淋巴細(xì)胞增殖活性：與假傷組比較,燙傷組的T淋巴細(xì)胞增殖活性及其細(xì)胞因子IL-2含量顯著降低。Abox干預(yù)后,T細(xì)胞增殖活性,T淋巴細(xì)胞增殖活性及其細(xì)胞因子IL-2含量較燙傷組顯著升高(P0.01)。結(jié)論正常小鼠心、肝、脾、肺組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞HMGB1蛋白和IL-35亞基(P35及EBI3) mRNA和蛋白表達(dá)均有表達(dá)。小鼠燙傷后,心、肝、脾組織中IL-35亞基(P35及EBI3) mRNA表達(dá)水平及IL-35蛋白水平明顯升高,而肺組織中P35及EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明顯下降。Abox可有效的降低燙傷小鼠心、肝臟、脾組織及脾臟單個(gè)核細(xì)胞對(duì)HMGB1、P35和EBI3 mRNA及IL-35蛋白的表達(dá)；促進(jìn)脾臟T細(xì)胞增殖,以及Th2為主的效應(yīng)T細(xì)胞向Thl為主的轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)Thl細(xì)胞的功能,從而有助于改善嚴(yán)重?zé)齻竺庖咭种茽顟B(tài)。
【關(guān)鍵詞】：高遷移率族蛋白B1 白介素35 T淋巴細(xì)胞 免疫抑制 燙傷
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R644
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-16
• 第一章 拮抗高遷移率族蛋白B1對(duì)燙傷小鼠白介素-35表達(dá)的影響16-40
• 1 資料與方法16-21
• 1.1 主要儀器與設(shè)備16-17
• 1.2 主要藥品與試劑17-18
• 1.3 動(dòng)物分組及模型制作18-19
• 1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法19-21
• 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法21
• 2 結(jié)果21-32
• 2.1 Abox干預(yù)對(duì)燙傷小鼠組織HMGB1表達(dá)的影響(表1.1—表1.3)21-25
• 2.2 Abox干預(yù)對(duì)燙傷小鼠體內(nèi)IL-35表達(dá)水平的影響25-32
• 3 討論32-40
• 第二章 拮抗高遷移率族蛋白B1對(duì)燙傷小鼠T淋巴細(xì)胞功能的影響40-51
• 1 資料與方法40-43
• 1.1 主要儀器與設(shè)備40-41
• 1.2 主要藥品與試劑41
• 1.3 動(dòng)物分組及模型制作41-42
• 1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法42-43
• 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法43
• 2 結(jié)果43-48
• 2.1 T淋巴細(xì)胞增殖活性43-45
• 2.2 IFN-γ及IL-4分泌水平45-48
• 3 討論48-51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 綜述58-71
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 縮略語(yǔ)表71-72
• 攻讀期間成果72-73
• 致謝73-75

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1 杜心W，

本文編號(hào)：871711