本文關鍵詞：靶向調控大鼠海馬CNN3基因表達對癲癇易感性的影響研究

  更多相關文章： CNN3 慢病毒 耐藥性癲癇 沉默 過表達

【摘要】：[目的]Calponin-3是調節(jié)興奮性突觸后膜樹突棘的動力蛋白,課題組前期研究提示癲癇患者及動物腦組織和腦脊液中的CNN3基因及其調控蛋白calponin-3均顯著升高,但確切機制不清。若能探明神經元calponin-3表達改變與癇性發(fā)作間的因果關系,揭示其中相關的環(huán)節(jié),可豐富我們對慢性癲癇腦內生化改變的認識、深化對耐藥性癲癇的發(fā)病機制的認識,為開發(fā)新藥物開辟新途徑。[方法]首先針對大鼠CNN3基因序列設計并鑒定能夠靶向干擾和過表達CNN3的慢病毒載體；將包裝產生的慢病毒顆粒立體定向注射入大鼠海馬即體內轉染大鼠海馬,通過western blot試驗檢測干擾和過表達CNN3基因的效果。動態(tài)觀察8周后,確定干擾和上調calponin-3表達的最佳序列和時間點,分別給對照組、CNN3干擾(CNN3-shRNA)組、CNN3過表達(CNN3-OE)組實驗大鼠腹腔注射氯化鋰和匹魯卡品進行癲癇點燃試驗。再通過腦電圖監(jiān)測及行為學觀察各組癲癇發(fā)生的潛伏期、持續(xù)時長、嚴重程度以及癲癇點燃的成功率來評估各組大鼠的癲癇易感性。最后在點燃成功后不同時間點,采用免疫印跡(western blot)實驗定量癲癇發(fā)作后對照組、CNN3-shRNA組和CNN3-OE組實驗鼠腦內calponin-3的變化情況,用膜片鉗技術記錄癲癇鼠海馬區(qū)場電位及全細胞電位。[結果]成功構建了CNN3-OE和3個CNN3-shRNA慢病毒干擾載體,轉染后8周內對海馬CNN3基因水平均有一定調控作用,其中CNN3-shRNA2載體組在轉染后的8周內海馬CNN3基因編碼蛋白calponin-3水平均顯著性下調,最高抑制率為73.26%；CNN3-OE慢病毒載體組中海馬calponin-3蛋白水平具有統(tǒng)計學意義的升高僅在轉染后第14天,上調率為93.88%。選擇CNN3-shRNA2載體和CNN3-OE以及它們對應的陰性對照組立體定向轉染大鼠海馬,在改變calponin-3蛋白表達水平最高的時間點與正常大鼠同時進行癲癇點燃,腦電圖監(jiān)測結果顯示各組大鼠均可記錄到癲癇樣腦電活動,表明癲癇模型構建成功。行為學研究顯示：CNN3-OE組癲癇發(fā)作的潛伏期為(29.17±19.08)min, CNN3-shRNA2的潛伏期為(40.717±28.40) min, CNN3-shRNA2組癲癇發(fā)作的潛伏期顯著長于CNN3-OE組,P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。但改變calponin-3蛋白水平后,各組實驗鼠誘導癲癇發(fā)作所需匹羅卡品劑量、癲癇發(fā)作的嚴重程度均無顯著性差異。點燃成功后的大鼠在癲癇發(fā)作1小時后麻醉下迅速取腦片,膜片鉗記錄海馬區(qū)場電位及全細胞電位均未記錄到癲癇樣放電。CNN3-shRNA2組大鼠點燃后的48H內calponin-3仍能保持在干預后的較低水平,僅在點燃后1w時升高,遠期未出現(xiàn)calponin-3的明顯升高；CNN3-0E組大鼠點燃后48H內calponin-3仍處于干預后較高的水平,在48H時出現(xiàn)明顯的升高,且升高趨勢持續(xù)到8W。[結論]本研究成功構建了上調和沉默CNN3基因表達的慢病毒載體,篩選出最佳的shRNA序列為shRNA2-1: 5'-gatccGGAGAACATCGGCAACTTTATAGAGAACTTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCTTTTTTg-3', shRNA2-2: 5'-aattcAAAAAAGGAGAACATCGGCAACTTTATAAGTTCTCTATAAAGTTGCCGATGTTCTCCg-----3',并經定位注射實現(xiàn)在體調控局部腦區(qū)CNN3基因表達,使大鼠海馬calponin-3蛋白表達水平顯著下降/上調50%以上,且這種高效的干擾效應一直持續(xù)到第8周,表明該技術可用于動物模型的基因功能研究,這將對闡明CNN3基因功能、深入了解突觸重塑和癲癇發(fā)病機制及開辟新的治療途徑等具有重要意義。通過進一步的干預實驗,我們發(fā)現(xiàn)適當?shù)慕档蚦alponin-3的表達水平后實驗鼠點燃誘發(fā)癲癇發(fā)作的閾值升高,這表明calponin-3的過表達與癲癇的發(fā)生有關,抑制calponin-3表達可降低癲癇易感性,可能具有抗癲癇效應,為開發(fā)新型抗癲癇藥物提供了重要的實驗依據(jù)。
【關鍵詞】：CNN3 慢病毒 耐藥性癲癇 沉默 過表達
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-35
• 結果35-47
• 討論47-51
• 結論51
• 參考文獻51-56
• 綜述56-65
• 參考文獻61-65
• 攻讀學位期間獲得的學術成果65-66
• 致謝66-67

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張芳;王麗君;張立志;楊瑩;王恒芳;王蕾;岳旺;;大鼠海馬快速點燃模型的建立及機制研究[J];腦與神經疾病雜志;2005年05期

2 楊柳;黃蔡華;;星瑙靈對大鼠海馬α-分泌酶活性的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2010年12期

3 李積勝,汪超,王靜,何偉,賀智;錳對大鼠海馬神經微絲蛋白表達的影響[J];武警醫(yī)學院學報;2000年04期

4 李玉紅,王德文,彭瑞云,李子建,董標,董方霆,梁月琴,胡文華;電磁脈沖對大鼠海馬氨基酸類神經遞質水平的影響[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2003年05期

5 黃永凱;方芳;羅湘穎;曾飛躍;周仁輝;盧明;陳成;方加勝;;新生大鼠海馬的顯微手術入路[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2008年02期

6 宿寶貴,許鹿希;大鼠海馬結構在空間辨別性學習記憶時的突觸形態(tài)可塑性的定量研究[J];解剖學研究;2000年01期

7 郭素紅,王曉玉,竇肇華,姚萍,張慧,李云義;不同強度的模擬推拉動作致大鼠海馬神經元損傷的實驗研究[J];航天醫(yī)學與醫(yī)學工程;2004年02期

8 鄺桂然;曾婷;黃海鵬;王曉燕;肖德生;;飲食中鐵含量和有氧運動對雄性大鼠海馬中鐵及其他金屬離子的影響[J];職業(yè)與健康;2013年10期

9 王秋桂,胡松林,何麗婭,陳業(yè)文;復方丹參對大鼠海馬缺血再灌的保護作用[J];基礎醫(yī)學與臨床;1997年06期

10 張?zhí)I,胡茂瓊,代小燕,劉義,王建枝;去勢雌性大鼠海馬區(qū)Tau蛋白Alzheimer樣磷酸化的變化[J];中國病理生理雜志;2004年12期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 史艷紅;徐平;宋凱英;潘成玉;;阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠海馬損害及其機制的研究[A];貴州省第六屆中西醫(yī)結合神經科學術年會論文匯編[C];2013年

2 雍政;顏玲娣;周培嵐;高翔;宮澤輝;;噻吩諾啡對大鼠海馬區(qū)突觸可塑性的影響[A];第十五屆中國神經精神藥理學學術會議論文摘要[C];2012年

3 王良;董大翠;蔡秋云;朱長庚;;谷氨酸鈉致癇大鼠海馬mGluR5的表達變化[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

4 李茂進;謝林;胡俊峰;李國珍;;天麻對鉛所致大鼠海馬損害的拮抗作用[A];山東預防醫(yī)學會首屆學術年會資料匯編[C];2003年

5 常曉慧;戰(zhàn)麗彬;白長川;吳美娟;馮召嵐;;組分中藥金智達膠囊對2型糖尿病大鼠海馬認知功能的改善作用及相關機制的研究[A];2011全國老年癡呆與衰老相關疾病學術會議第三屆山東省神經內科醫(yī)師（學術）論壇論文匯編[C];2011年

6 戴薇薇;金國琴;張學禮;趙偉康;;左舊丸、右舊丸對老年大鼠海馬、杏仁核氨基酸類神經遞質含量變化的影響[A];第七次全國中西醫(yī)結合虛證與老年病學術會議論文摘要集[C];2003年

7 史艷紅;徐平;宋凱英;潘成玉;;阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征大鼠海馬損害機制及其與低氧的相關性[A];貴州省第六屆中西醫(yī)結合神經科學術年會論文匯編[C];2013年

8 馮榮芳;馮亞青;郭振華;邢邯英;李淑琴;;膠質纖維酸性蛋白在老年癡呆大鼠海馬中的表達[A];中華醫(yī)學會第八次全國老年醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2007年

9 劉瓊;朱海燕;俞瑾;米文麗;毛應啟梁;王彥青;吳根誠;;大鼠海馬膠質細胞在抑郁癥及電針抗抑郁模型治療中的作用研究[A];第九屆全國針刺麻醉針刺鎮(zhèn)痛及針刺調整效應學術研討會論文集[C];2007年

10 陳琛;朱文榮;耿德勤;;氟西汀+電針治療對抑郁模型大鼠海馬神經元凋亡的影響[A];中華醫(yī)學會第十次全國精神醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2012年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;電針能激活老年癡呆大鼠海馬蛋白激酶信號通路[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高永軍;深低溫停循環(huán)時大鼠海馬線粒體差異蛋白質組學的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2014年

2 李斌;黃連解毒湯對2型糖尿病大鼠海馬Alzheimer病樣tau蛋白磷酸化途徑的影響及機制研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2015年

3 姚星;右美托咪定對術后認知功能障礙大鼠海馬炎癥反應的影響[D];武漢大學;2013年

4 段開明;異氟烷對成齡和老齡大鼠海馬蛋白質組影響的差異性研究[D];中南大學;2007年

5 周爽;電針對高血壓性腦出血大鼠海馬信號轉導機制的影響[D];湖北中醫(yī)學院;2003年

6 杜會枝;乙酰膽堿酯酶抑制劑和金屬離子對大鼠海馬細胞膜離子通道的作用研究[D];山西大學;2006年

7 楊惠云;老年性癡呆大鼠海馬突觸體的蛋白質組學研究[D];天津醫(yī)科大學;2009年

8 羅松;電針對老年癡呆大鼠海馬神經元突觸形態(tài)可塑性的影響機制[D];成都中醫(yī)藥大學;2003年

9 劉瓊;針刺治療實驗性抑郁癥時成年大鼠海馬神經發(fā)生的變化[D];復旦大學;2008年

10 劉雨星;電針對老年性癡呆大鼠海馬組織信號轉導介質的調節(jié)作用研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2003年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賈楠;NSE在AD模型大鼠海馬內及VD患者血清內的表達[D];河北大學;2015年

2 劉錚;頭部淺低溫對全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬細胞線粒體膜電位及細胞凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學;2015年

3 趙艷穎;丁苯酞、卡馬西平對大鼠海馬、小腦神經元凋亡及認知功能影響的研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

4 袁強;肢體缺血預處理腦保護作用及上調p38 MAPK和ERK的體液機制[D];河北醫(yī)科大學;2015年

5 王潔;針刺不同配穴對心肌缺血大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB表達的影響[D];安徽中醫(yī)藥大學;2015年

6 原宇宙;葉酸干預對染鋁大鼠海馬Aβ相關基因甲基化影響的研究[D];山西醫(yī)科大學;2015年

7 范少華;MiR210和Stat3全腦缺血大鼠腦組織的表達通過HIF-1α通路對神經元凋亡的影響[D];山東大學;2015年

8 趙旭;SAH對大鼠海馬區(qū)神經細胞自噬的影響及BQ-123的干預作用[D];華北理工大學;2015年

9 隋竹欣;抑郁大鼠海馬神經元結構改變及機制研究[D];華北理工大學;2015年

10 段麗君;依達拉奉對低氧大鼠海馬區(qū)JNK/P38表達及神經元凋亡的影響[D];華北理工大學;2015年

，

本文編號：788138