本文關(guān)鍵詞：離體肝細(xì)胞Hsa-miR-660基因表達(dá)調(diào)控對(duì)CYP3A4蛋白表達(dá)的影響

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【摘要】：背景及目的 芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥物,鎮(zhèn)痛作用好,是嗎啡鎮(zhèn)痛作用的50-100倍,廣泛應(yīng)用于臨床麻醉以及癌癥病人的鎮(zhèn)痛治療中。臨床工作中發(fā)現(xiàn),不同患者使用同等劑量的芬太尼產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果和副作用明顯不同。芬太尼主要通過(guò)肝臟中CYP3A4酶進(jìn)行代謝成為幾乎沒有活性的去甲基芬太尼,研究發(fā)現(xiàn),不同患者的CYP3A4酶活性差異性很大,而基因多態(tài)性是影響CYP3A4酶活性的主要因素[1,2]。近年來(lái),人們研究發(fā)現(xiàn)一種小分子單鏈RNA(miRNA)可以作用于基因的轉(zhuǎn)錄后過(guò)程,影響蛋白的表達(dá),在生命的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[3,4]。肝臟組織中也發(fā)現(xiàn)了多種miRNA,但是這些miRNA有些是無(wú)功能的,有些是有功能的,需要進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。有研究指出Hsa-miR-660可能與CYP3A4酶活性存在相關(guān)性,但尚且沒有進(jìn)行細(xì)胞水平的驗(yàn)證[5]。本實(shí)驗(yàn)主要研究肝細(xì)胞中Hsa-miR-660相對(duì)表達(dá)量對(duì)CYP3A4蛋白表達(dá)的影響。材料與方法 所用的細(xì)胞為人正常肝細(xì)胞chang liver,將穩(wěn)定表達(dá)的chang liver細(xì)胞培養(yǎng)于37°5%co2的培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清rpmi1640,2-3天換一次培養(yǎng)基,保證細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)。在細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)可準(zhǔn)備病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞鋪于6孔板上,繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),在細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為四組:分別為對(duì)照組(c)、mirna過(guò)表達(dá)組(h)、mirna沉默組(l)和陰性載體組(n)。c組加入等量的完全培養(yǎng)基,l組加入包裹抑制hsa-mir-660表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒,h組加入包裹過(guò)表達(dá)hsa-mir-660質(zhì)粒的慢病毒,n組加入包裹空載體的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)按moi=50加入病毒后共同培養(yǎng),24小時(shí)后將含有病毒的培養(yǎng)基吸出,加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48-72h后進(jìn)行在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后一部分細(xì)胞提取總rna,實(shí)時(shí)熒光定量法進(jìn)行測(cè)定cyp3a4mrna相對(duì)表達(dá)量和hsa-mir-660相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參分別為gapdh和u6。剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)較為旺盛時(shí)提取總蛋白,westernblot法測(cè)定cyp3a4的相對(duì)表達(dá)量,內(nèi)參為gapdh。結(jié)果1轉(zhuǎn)染效率測(cè)定熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,h組、l組、n組三組轉(zhuǎn)染效率均為50%-70%。2hsa-mir-660相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定實(shí)時(shí)熒光定量pcr法測(cè)定四組hsa-mir-660相對(duì)表達(dá)量,f=31.857,p〈0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.n組與c組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.564〉0.05).h組較c組hsa-mir-660表達(dá)量顯著增加,l組較c組hsa-mir-660表達(dá)量顯著降低。h組(8.372±0.403)較n組(4.847±0.511)hsa-mir-660表達(dá)量顯著增加,l組(2.985±0.407)較n組(4.847±0.511)hsa-mir-660表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3cyp3a4mrna表達(dá)量的測(cè)定rt-pcr法測(cè)定四組cyp3a4mrna,四組mrna的表達(dá)量不存在差異,f=0.381,p=0.7680.05。4cyp3a4蛋白表達(dá)量的測(cè)定westernblot法測(cè)定四組cyp3a4蛋白相對(duì)表達(dá)量,四組之間cyp3a4蛋白的相對(duì)表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,f=20.225,p〈0.01。c組和n組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〉0.05),h組較c組cyp3a4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低,l組較c組cyp3a4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高;h組(0.00548±0.00186)較n組(0.01768±0.04633)cyp3a4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低,l組(0.04092±0.01112)較n組(0.01768±0.04633)cyp3a4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高,差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〈0.01)。結(jié)論 1、Hsa-miR-660并不影響CYP3A4 m RNA的穩(wěn)定性。2、細(xì)胞水平上Hsa-miR-660抑制了CYP3A4蛋白的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：Hsa-miR-660 CYP3A4 chang liver細(xì)胞系
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R614
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 英文縮寫索引12-13
• 前言13-16
• 材料和方法16-27
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-30
• 討論30-33
• 結(jié)論33-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 綜述 microRNA與阿片類藥物的相關(guān)性研究36-54
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及碩士期間論文發(fā)表情況54-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 歐陽(yáng)松應(yīng),楊冬,歐陽(yáng)紅生,馬鶴雯;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2004年01期

2 ;MicroRNA signatures in liver diseases[J];World Journal of Gastroenterology;2009年14期

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本文編號(hào)：777412