本文關(guān)鍵詞：JNK1與TIPE2在感染后膈肌無力發(fā)生中調(diào)控機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 膈肌無力 JNK1 TIPE2 SP600125

【摘要】：背景在人體與呼吸有關(guān)的呼吸肌中,膈肌(diaphragm)是最重要的,呼吸肌功能的60%~80%都是由膈肌完成的,所以膈肌對(duì)于維持生物體的呼吸功能具有不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體在受到病毒、細(xì)菌等引起的感染時(shí)會(huì)引起膈肌收縮功能障礙,出現(xiàn)無力現(xiàn)象,但是對(duì)于該現(xiàn)象的機(jī)制一直沒有研究清楚。臨床上造成感染的可能原因比較廣泛復(fù)雜,比如胸腹部感染,敗血癥和感染性休克等,我們課題組一直從事于膈肌無力機(jī)制的研究,對(duì)于LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥型大鼠中膈肌功能障礙研究具有一定前期基礎(chǔ),對(duì)于其相關(guān)發(fā)生機(jī)制的研究是本實(shí)驗(yàn)的主要目的。根據(jù)本組之前研究的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)JNK1通路在膈肌無力的發(fā)病過程中具有明顯作用,據(jù)此本實(shí)驗(yàn)利用LPS(Lipopolysaccharide)作用于大鼠造成感染,構(gòu)建大鼠膈肌肌無力模型,研究LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥大鼠中可能導(dǎo)致膈肌功能障礙的有關(guān)蛋白的表達(dá)及其變化情況,同時(shí)腹腔注射SP600125(JNK1抑制劑),觀測(cè)JNK1通路被抑制之后,大鼠膈肌的有關(guān)功能是否得到保護(hù),大鼠膈肌的收縮功能是否得到某種程度上的恢復(fù)。TIPE2作為免疫負(fù)調(diào)控因子在炎癥的過程中起到非常重要的作用,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)TIPE2等基因做了檢測(cè),以期闡明JNK1通路中有關(guān)蛋白的表達(dá)情況以及TIPE2基因在膈肌無力中起到的作用。目的構(gòu)建內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌無力模型,研究JNK1通路有關(guān)蛋白以及TIPE2基因在膈肌無力中的作用,同時(shí)構(gòu)建小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞LPS感染模型,進(jìn)一步研究JNK1通路的有關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法雄性SD大鼠40只,精神狀態(tài)良好,體重180~220g,用隨機(jī)分組的方法分為對(duì)照組、LPS模型組以及LPS+SP600125(JNK1抑制劑)組。給藥方法:對(duì)照組的10只大鼠給予腹腔注射生理鹽水;LPS組15只,腹腔(i.p)注射LPS(12mg/kg);LPS+SP600125組15只,腹腔(i.p)注射LPS的同時(shí)給予腹腔注射SP600125(30μM/kg)所有分組處理24h后處死;另外,每組皮下注射30ml/kg的生理鹽水。24h后將大鼠進(jìn)行麻醉行氣管插管,記錄呼吸功能有關(guān)參數(shù)、對(duì)動(dòng)脈血?dú)膺M(jìn)行分析并且將大鼠膈肌離體分離制備膈肌肌條分別測(cè)定單收縮張力(Pt)同時(shí)測(cè)定最大強(qiáng)直張力(Po)、進(jìn)而用Med Lab信號(hào)采集系統(tǒng)收集峰值收縮時(shí)間(CT)、半舒張時(shí)間(1/2RT)、張力最大上升速率(+d T/dtmax)、張力最大下降速率(-d T/dtmax)、張力-頻率曲線(Force-frequency curve)及疲勞指數(shù)(FI)的變化,同時(shí)收集膈肌標(biāo)本用于Western Bolt、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)測(cè)定有關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況,并用HE染色和免疫組化的方法觀察膈肌組織的形態(tài)變化。構(gòu)建JNK1、TIPE2過表達(dá)和沉默質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12感染模型中利用Western Blot、RT-PCR以進(jìn)一步探討JNK1通路、TIPE2基因在膈肌無力中的作用機(jī)制。結(jié)果(1)與對(duì)照組相比,LPS組大鼠無論在潮氣量還是肺通氣量及最大肺通氣量均明顯降低(P0.01)。LPS+SP600125組與LPS組比較各值均明顯提高(P0.01)。(2)與對(duì)照組相比,LPS組大鼠膈肌Pt、Po、+d T/dtmax、-d T/dtmax明顯降低,CT、1/2RT明顯增高(P0.01)。LPS+SP600125組與LPS組比較,大鼠膈肌的Pt、Po、+d T/dtmax、-d T/dtmax顯著提高(P0.01),CT、1/2RT明顯降低(P0.01);LPS+SP600125組與對(duì)照組比較,Pt、Po、CT、1/2RT、+d T/dtmax、-d T/dtmax差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)Western Blot顯示LPS組TIPE2、p-JNK的表達(dá)量明顯升高,而JNK1無明顯變化,LPS+SP600125組JNK1得到抑制之后,JNK1的激活體表達(dá)降低,TIPE2的表達(dá)表達(dá)亦呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),RT-PCR得到一致結(jié)果。(4)利用HE染色方法顯示,對(duì)照組大鼠的膈肌肌纖維形狀較為規(guī)則,排列相對(duì)整齊,相比而言LPS組大鼠的膈肌肌纖維則呈現(xiàn)出走向紊亂狀況,甚至斷裂溶解,間質(zhì)水腫。(5)免疫組化結(jié)果顯示TIPE2在LPS組的表達(dá)明顯高于Control組,顏色較深,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),JNK1的檢測(cè)結(jié)果顯示無明顯變化。(6)不同時(shí)間點(diǎn)的C2C12肌細(xì)胞感染模型顯示,p-JNK、TIPE2隨著LPS刺激時(shí)間的增加表達(dá)增多,24h之后表達(dá)會(huì)下降。之后又構(gòu)建JNK1、TIPE2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞,利用RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),兩者的表達(dá)趨勢(shì)呈正相關(guān)性,這與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論1、內(nèi)毒素血癥大鼠出現(xiàn)膈肌無力表現(xiàn),注射SP600125之后膈肌功能得到改善,SP60125可能對(duì)膈肌具有一定的保護(hù)作用。2、LPS刺激大鼠之后可以激活JNK1通路,p-JNK、TIPE2表達(dá)升高;JNK1被抑制之后,p-JNK、TIPE2表達(dá)下降,膈肌收縮能力恢復(fù),提示大鼠膈肌收縮能力的變化可能與JNK1通路的調(diào)控有關(guān)。3、JNK1與TIPE2存在正向調(diào)控關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：膈肌無力 JNK1 TIPE2 SP600125
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R565
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-14
• 引言14-16
• 1 前言16-18
• 2 材料、儀器與試劑18-26
• 2.1 材料與試劑18-20
• 2.2 儀器20-21
• 2.3 部分溶劑配制方法21-26
• 3 實(shí)驗(yàn)方法26-40
• 3.1 動(dòng)物模型建立26
• 3.2 動(dòng)物模型相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)26-28
• 3.3 總RNA的提取28-29
• 3.4 引物設(shè)計(jì)29-30
• 3.5 CDNA第一鏈的合成30
• 3.6 REAL- TIME PCR擴(kuò)增目的基因30-31
• 3.7 蛋白質(zhì)的提取及BCA法測(cè)定蛋白濃度31-32
• 3.8 WESTERN BLOT蛋白凝膠電泳32-33
• 3.9 膈肌標(biāo)本的免疫組化33-34
• 3.10 感受態(tài)的制備34
• 3.11 TIPE2過表達(dá)載體的構(gòu)建34-37
• 3.12 JNK1慢病毒載體以及TIPE2慢病毒載體的構(gòu)建37
• 3.13 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染37-38
• 3.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38-40
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-50
• 4.1 動(dòng)物模型的成功構(gòu)建40-42
• 4.1.1 各組大鼠一般情況40
• 4.1.2 呼吸功能的測(cè)定40
• 4.1.3 動(dòng)脈血?dú)夥治?/span>40-41
• 4.1.4 膈肌收縮特性41
• 4.1.5 膈肌耐力的變化41-42
• 4.1.6 膈肌肌張力-頻率關(guān)系42
• 4.2 形態(tài)學(xué)觀察以及部分基因檢測(cè)42-45
• 4.2.1 大鼠膈肌HE染色42-43
• 4.2.2 膈肌免疫組化結(jié)果43
• 4.2.3 WESTERN BLOT檢測(cè)部分蛋白質(zhì)表達(dá)43-45
• 4.2.4 REAL-TIME PCR檢測(cè)部分基因45
• 4.3 JNK1與TIPE2的相互調(diào)節(jié)關(guān)系45-50
• 4.3.1 LPS刺激之后不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)情況45-46
• 4.3.2 TIPE2過表達(dá)載體的構(gòu)建46-48
• 4.3.3 JNK1與TIPE2的表達(dá)相互調(diào)節(jié)關(guān)系48-50
• 討論50-54
• 結(jié)論54-56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 綜述58-70
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 致謝70-72
• 在讀期間參加的學(xué)術(shù)會(huì)議及研究成果72-73

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