發(fā)布時間：2020-04-17 23:26

【摘要】：研究背景在我國,隨著麻醉技術(shù)水平不斷發(fā)展和“二胎”政策的開放,每年有成千上萬名新生兒及嬰幼兒甚至孕婦需接受必要的診斷性檢查、手術(shù)以及鎮(zhèn)痛治療等,需要進行全身麻醉。既往認為,全身麻醉是一種可逆性的意識改變,而近幾十年的動物實驗、臨床回顧性分析結(jié)果顯示麻醉藥物本身可能對胎兒及小兒神經(jīng)發(fā)育有潛在風(fēng)險,這也成為越來越多臨床麻醉工作者、家長及社會廣泛關(guān)注的熱點問題。丙泊酚(propofol,2,6-二異丙基苯酚)作為臨床上目前最常用的靜脈麻醉藥,具有起效快、蘇醒迅速、持續(xù)輸注后無蓄積、不良反應(yīng)少等優(yōu)點,被廣泛用于各類手術(shù)的全身麻醉。有關(guān)丙泊酚對神經(jīng)毒性的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡增多、影響突觸發(fā)生和塑形障礙,甚至導(dǎo)致短期或長期的行為學(xué)異常。雖然神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮主要功能的細胞,但是神經(jīng)膠質(zhì)細胞總共占神經(jīng)細胞的50%,越是高等的動物,神經(jīng)膠質(zhì)細胞所占比例越高,而少突膠質(zhì)細胞占全部神經(jīng)膠質(zhì)細胞的70%,其主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)和維持神經(jīng)元的正常功能,而髓鞘是保證神經(jīng)信號快速、準(zhǔn)確、單向傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)。其中,髓鞘堿性蛋白MBP是成熟少突膠質(zhì)細胞的標(biāo)志性蛋白,也是髓鞘結(jié)構(gòu)的重要組成成分,在成髓鞘過程中發(fā)揮重要的作用。少突膠質(zhì)細胞發(fā)育成熟的過程中會受到多種信號的調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄因子Olig2主要參與少突膠質(zhì)細胞早期的定向發(fā)育和分化,而Oligl主要在髓鞘形成的終末階段發(fā)揮作用。此外,Olig1、Olig2還可正性調(diào)控MBP啟動序列的轉(zhuǎn)錄。近期研究發(fā)現(xiàn),新生獼猴和孕期獼猴接觸丙泊酚5h,可誘發(fā)胎兒腦部神經(jīng)元的凋亡增多,并在少突膠質(zhì)細胞形成髓鞘的起始時期誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞的凋亡增多,另外,胎兒期相對于新生獼猴丙泊酚暴露,大腦神經(jīng)細胞的受損情況更加嚴重。胎兒期是各類神經(jīng)細胞發(fā)育的起始階段,也是少突膠質(zhì)細胞增殖分化、成熟的重要時刻,此時暴露于丙泊酚是否會對胎兒發(fā)育中大腦的少突膠質(zhì)細胞成熟和髓鞘化產(chǎn)生不利影響,還需進一步探索。我們在前期研究中建立了胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露模型,發(fā)現(xiàn)丙泊酚可導(dǎo)致3dpf幼魚腦部神經(jīng)細胞凋亡增多并在MBP生成初期下調(diào)其表達。本研究,將進一步觀察不同發(fā)育階段的胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露所致行為學(xué)改變及MBP下調(diào)的作用機制。研究目的1.觀察胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露對不同發(fā)育時期幼魚MBP表達的持續(xù)性影響2.觀察胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露對不同發(fā)育時期幼魚行為改變3.探究胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露對引起MBP表達下降的可能機制研究內(nèi)容與方法1.實驗動物與分組選用成年野生型和轉(zhuǎn)基因Tg(mbp:GFP)、Tg(olig2:DsRed2)斑馬魚,雌雄各半,魚齡6個月-1年左右,下午18:00將雌雄成魚按1:1或1:2比例配對,次日待雌魚產(chǎn)卵后將胚胎收集置于28.5℃的恒溫孵箱中。6h后,用吸管吸除死卵,將剩余卵隨機分組到六孔板中,每孔30卵,加入含有200μg/m、30μg/ml丙泊酚的幼魚孵化液,同時設(shè)立空白對照組、DMSO組(0.014%),每孔5ml。24hpf時移除死卵,更換各分組一半受試液,48hpf時,所有組別更換為新鮮幼魚孵化液。對需要拍照觀察的幼魚,需加入0.003%PTU,抑制色素保持魚體透明。2.qRT-PCR、Western-Blot 法檢測MBP和olig2的 mRNA、蛋白表達收集不同發(fā)育階段幼魚組織,提取RNA和蛋白,通過實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測MBP和olig2的mRNA、蛋白表達情況3.幼魚行為學(xué)檢測利用noldus行為跟蹤系統(tǒng)和分析軟件導(dǎo)出幼魚運動參數(shù),分析行為變化4.TUNEL檢測少突膠質(zhì)細胞凋亡收集不同發(fā)育階段Tg(mbp:GFP)幼魚,制作冰凍切片,利用TUNEL、免疫熒光雙標(biāo)染色檢測凋亡情況5.吖啶橙檢測少突膠質(zhì)前體細胞凋亡用吖啶橙染料對48hpf Tg(olig2:DsRed2)轉(zhuǎn)基因幼魚活體凋亡染色,檢測少突膠質(zhì)前體細胞的凋亡情況6.EDU檢測少突膠質(zhì)前體細胞增殖使用EDU標(biāo)記S期增殖細胞,制作Tg(olig2:DsRed2)轉(zhuǎn)基因幼魚冰凍切片,并進行染色,檢測前體細胞增殖情況7.統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,One-Way ANOVA單因素方差分析。分別采用LSD(方差齊時)或Tamhane(方差不齊時),P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用GraphPad Prism6.0作圖軟件和image J灰度值分析。研究結(jié)果1.3dpf、7dpf MBPmRNA表達下調(diào)(P0.05),3dpf、7dpf、10dpfMBP蛋白表達均下調(diào)(P0.05);olig2 mRNA、蛋白在48hpf表達下降(P0.05);DMSO組與對照組相比,無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.5dpf幼魚運動活力、對環(huán)境適應(yīng)能力明顯減弱(P0.05),7dpf幼魚環(huán)境適應(yīng)能力、對刺激的反應(yīng)速度有所減弱(P0.05),1Odpf幼魚各項結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.3dpf各濃度組和7dpf較高濃度組少突膠質(zhì)細胞凋亡數(shù)目顯著增多(P0.05);48hpf少突膠質(zhì)前體細胞凋亡數(shù)目成濃度依賴性增多(P0.05)。4.胚胎期丙泊酚暴露后少突膠質(zhì)前體細胞增殖率未發(fā)生明顯變化(P0.05)結(jié)論1.胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露后可持續(xù)抑制幼魚MBP表達至1Odpf。2.胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露可導(dǎo)致5dpf、7dpf幼魚發(fā)生行為改變。3.胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露后幼魚MBP表達減少可能與丙泊酚下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子olig2表達,以及促進少突膠質(zhì)細胞及其前體細胞的凋亡增多有關(guān)。4.胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露不會明顯抑制少突膠質(zhì)前體細胞的增殖。
【圖文】：

幼魚的安全感明顯增加，表現(xiàn)為運動興奮。各時間點內(nèi)的結(jié)果顯示，５ｄｐｆ逡逑３（Ｖｇ／ｍｌ丙泊酚暴露組，，無論在黑暗還是光照周期內(nèi)，幼魚的運動活力與正常對逡逑照組相比明顯降低（Ｐ＜０．邋０５）（見圖１－４圖Ａ），說明幼魚對外界刺激的反應(yīng)性逡逑均變?nèi)�，對強光與黑暗交替刺激下的環(huán)境表現(xiàn)為不適應(yīng)；而７ｄｐｆ幼魚３０ｐｇ／ｍｌ逡逑２２逡逑

結(jié)果顯示，與對照組相比，ｏｌｉｇ２蛋白在４８ｈｐｆ的表達呈劑量依賴性下降（Ｐ逡逑＜０．邋０５），而７ｄｐｆ、ｌＯｄｐｆ丙泊酸暴露組ｏｌｉｇ２蛋白表達與對照組相比，無顯著逡逑性差異0Ｐ＞0．邋0５）（見表２－７、圖２－２）。逡逑表２－７不同組別各發(fā)育時期ｏｌｉｇ２蛋白表達比較（ｉ±ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－７．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｌｉｇ２邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅｓ邋（邋ｘ土ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ邐ｎ邐４８ｈｐｆ邐７ｄｐｆ邐ｌＯｄｐｆ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邐３邐０．９２士邋０．０４邐ｌ邋．０４邋士０．０３邐０．９６±０．０８逡逑２０＾ｌ／ｍｌ邐３邐０．５８士邋０．０４＋邐ｌ邋．０７邋士邋０．０７邐ｌ．０５邋士邋０．０６逡逑３０（ｉｌ／ｍｌ邐３邐０．２ｌ±０．０５＋＃邐ｌ．０３邋土邋０．０５邐ｌ．００邋士邋０．０３逡逑Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ邋ＬＳＤ邋多重比較方法邋＊尸邋＜０？邋０５邋ｖｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＃尸邋＜０？邋０５邋ｖｓ邋２０｝ｉｌ／ｍｌ逡逑ｎ代表實驗重復(fù)次數(shù)，８０條魚／組／次逡逑４４逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R614

【相似文獻】

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1 劉川;胚胎期斑馬魚丙泊酚暴露抑制MBP蛋白表達及機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2631430