【摘要】：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以軟骨退行性病變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病,是老年人群疼痛和致殘的主要原因。OA病因復(fù)雜,傳統(tǒng)觀點認為主要由機械因素及年齡相關(guān)的軟骨退變所致。但近年來越來越多的證據(jù)顯示,代謝綜合征(]metabolic syndrome)與OA有密切聯(lián)系。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),OA患者的代謝綜合征發(fā)病率明顯增加。作為代謝綜合征的重要組成部分,糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)與OA關(guān)系密切,并可能是OA發(fā)病的一個獨立危險因素。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),非胰島素依賴型糖尿病患者更易患OA,且OA人群患糖尿病的風險較對照組人群患糖尿病的風險高。此外,有研究發(fā)現(xiàn),以鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)糖尿病,大鼠軟骨出現(xiàn)胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor1, IGF-1)抵抗,70天后滑膜結(jié)構(gòu)重塑,膠原沉積。這些研究均提示糖尿病與OA之間存在密切關(guān)聯(lián),而高血糖作為糖尿病最直接的表現(xiàn),其在糖尿病性O(shè)A發(fā)生發(fā)展中的作用目前鮮有報道。 OA不僅僅是關(guān)節(jié)軟骨的損傷,也可觀察到其它關(guān)節(jié)組織(如滑膜)的病理性改變。OA的初始表現(xiàn)大多是滑膜病變,這些病變一般要早于關(guān)節(jié)軟骨的X線或MRI的影像學(xué)表現(xiàn)�；ぱ着cOA的許多臨床癥狀相關(guān),可反映疾病的結(jié)構(gòu)性進展�；ぱ椎膰乐爻潭瓤商崾倔x股關(guān)節(jié)軟骨病將如何進展。由于一些可溶性介質(zhì)的活性,滑膜炎成為OA發(fā)病機制的關(guān)鍵因素。參與OA發(fā)病機制的兩個主要細胞因子,IL-1β和TNF,主要由活化的滑膜細胞、單核細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞產(chǎn)生。此外,在OA進程中,滑膜可產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase),促進軟骨基質(zhì)降解�；ぴ贠A發(fā)病中的重要作用及其作為治療靶標的可能性已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激是真核細胞在受到外界刺激時的一種保護性應(yīng)激反應(yīng),通過誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)來進行適應(yīng)性調(diào)節(jié),UPR則通過抑制蛋白的合成,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達以此促進蛋白折疊以及加速未折疊蛋白或錯誤折疊的蛋白的降解來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激偶聯(lián)炎癥反應(yīng)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括糖尿病和OA。OA軟骨的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(Glucose regulation protein78,Grp78)和Bcl-2交互蛋白(Bc12-Interacting Protein-1,Bag-1)較正常軟骨表達增高。更有研究表明,細胞內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物的聚集通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡。此外,有研究證明了關(guān)節(jié)炎滑膜和滑膜細胞高表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因。 為證實糖尿病慢性高糖暴露可致OA,且滑膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用,本研究通過動物實驗建立1型糖尿病和OA模型,并在細胞和分子水平證實高糖的損傷作用及其可能的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制,在整體和細胞水平證實我們的假說。 第一部分糖尿病大鼠OA易感現(xiàn)象 目的：流行病學(xué)調(diào)查和臨床試驗研究提示糖尿病與OA關(guān)系密切,本部分擬通過整體動物實驗,證實糖尿病大鼠關(guān)節(jié)軟骨質(zhì)量下降,長距離跑步刺激下OA易感現(xiàn)象。 方法：成年wistar雄性大鼠STZ(60mg/kg)一次性腹腔注射,2周后大鼠斷尾取血檢測糖尿病造模成功率。糖尿病造模成功大鼠正常飲食一月后,給予長距離跑步(每日以20m/mmin的速度跑55mmin,共6周,總跑步里程30Km)誘導(dǎo)OA。跑步結(jié)束后,異氟烷麻醉處死大鼠。取部分膝關(guān)軟骨節(jié)行墨汁染色,觀察大體形態(tài)改變并進行軟骨大體形態(tài)評分。剩余膝關(guān)節(jié)組織固定、包埋、脫鈣切片后,行HE和番紅O染色,Ⅱ型膠原免疫組化,光鏡下觀察軟骨病理改變,并行OA的Mankin's評分。此外,膝關(guān)節(jié)滑膜行HE和MMP-13、NF-KB免疫組化。 結(jié)果：①糖尿病大鼠OA造模前后血糖變化：大鼠STZ腹腔注射后一周尾靜脈血糖為23.83±1.34mmol/L,對照組血糖為5.90+1.34mmo1/L,兩組間統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P0.01),糖尿病造模成功率100%；跑步6周后,糖尿病組大鼠血糖為32.16+1.14mmol/L,對照組血糖為7.19±0.47mmo1/L,糖尿病大鼠在整個實驗過程中均處于高血糖狀態(tài)；②關(guān)節(jié)軟骨大體改變及評分：與對照組相比,正常大鼠接受跑步刺激后,其關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)正常,關(guān)節(jié)表面較光滑；糖尿病大鼠接受跑步刺激后,其關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)較嚴重磨損,行墨汁染色后發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨表面明顯毛糙,糖尿病組軟骨大體評分均較對照組明顯升高(P0.01)；③關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)改變及評分：跑步后大鼠膝關(guān)節(jié)石蠟切片行番紅0染色后發(fā)現(xiàn),對照組基質(zhì)染色明顯,表面出現(xiàn)輕度毛糙；與對照組相比,糖尿病組出現(xiàn)不同程度的軟骨表面缺損,軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂,軟骨厚度變薄,基質(zhì)淡染,軟骨細胞數(shù)明顯減少；免疫組化示糖尿病鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原蛋白表達降低。跑步誘導(dǎo)OA后,糖尿病組軟骨OA病理Mankin's評分升高至11.9分,較對照組(1.6分)明顯增高(P0.01)；④滑膜病理改變：糖尿病大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜襯里細胞層增厚,間質(zhì)細胞數(shù)增多,出現(xiàn)炎性細胞浸潤,滑膜炎組織學(xué)評分明顯增高(P0.01),免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,MMP-13和NF-κB的蛋白表達顯著升高(P0.01)。 結(jié)論：糖尿病損傷大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜,在接受過量跑步負荷誘導(dǎo)OA后,膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)典型的OA病理改變,提示,糖尿病高糖狀態(tài)可致大鼠OA易感,滑膜炎可能參與糖尿病OA發(fā)生。 第二部分高糖通過損傷滑膜引起軟骨細胞病理變化 目的：本部分研究擬在細胞水平證實高糖對關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的損傷作用及其相互作用機制。 方法：以不同濃度葡萄糖(10、20、30、40mM)分別處理大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞和成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS)3天和10天,實時定量PCR檢測細胞基質(zhì)合成(col2al、aggrecan)、基質(zhì)降解(MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、 ADAMTS、 TIMP-1和TIMP-3),以及炎癥因子(IL-6/TNF-a)和凋亡相關(guān)基因(caspase-3、 caspase-8、 caspase-9和Bcl-2)的表達。檢測FLS培養(yǎng)液中MDA和SOD的改變。然后,以30mM葡萄糖處理FLS3天的細胞培養(yǎng)液刺激軟骨細胞3天,檢測軟骨細胞基質(zhì)合成、基質(zhì)降解、炎癥和凋亡改變。 結(jié)果：①對軟骨細胞：高糖刺激3天和10天對軟骨細胞的活力無明顯影響；3天時軟骨基質(zhì)合成相關(guān)基因col2al和aggrecan表達增加,10天時增加更為顯著；基質(zhì)降解重要基因在3天時顯著降低,但高糖刺激10則轉(zhuǎn)為升高；凋亡相關(guān)基因在3天和10天均未見明顯變化；IL-6和TNF-α在10天明顯升高。②對FLS：高糖刺激3天時對滑膜細胞活力有促進作用,10天時轉(zhuǎn)為抑制：高糖處理3天時FLS促炎、降解和凋亡相關(guān)基因即明顯升高,并且升高的程度在高糖刺激10天時更為顯著；此外,高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的FLS培養(yǎng)液上清中SOD含量呈葡萄糖濃度依賴性降低,MDA濃度依賴性升高。③滑膜培養(yǎng)液對軟骨細胞：30mM高糖的滑膜培養(yǎng)液培養(yǎng)軟骨細胞后,軟骨細胞基質(zhì)合成顯著下降,促基質(zhì)降解酶表達增強,促炎因子IL-6和TNF-α顯著升高；凋亡相關(guān)基因均未見明顯變化。 結(jié)論：FLS較軟骨細胞更易受高糖損傷。高糖可能通過刺激FLS分泌炎癥和降解因子,從而引起軟骨細胞病理損害。氧化損傷可能參與了這一過程。 第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與高糖所致滑膜損傷 目的：擬在細胞分子水平,進一步探討高糖損傷FLS的機制,證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與糖尿病性O(shè)A。 方法：①高糖誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：高糖分別處理軟骨細胞和FLS24/48/72小時,檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志基因表達；②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)的證實：實驗分四組,正常對照組(10mM葡萄糖)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)組(10mM葡萄糖+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素5μg/m)、高糖對照組(30mM葡萄糖)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制組(30mM葡萄糖+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-丁酸苯酯1mM),分別處理FLS2/4/8/16小時,檢測滑膜細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡和基質(zhì)降解相關(guān)基因表達情況。 結(jié)果：①高糖誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞和FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：軟骨細胞高糖處理24、48和72小時結(jié)果顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志基因C/EBP同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)呈時間依賴性升高,升高在72小時具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,NF-κB和生長靜止DNA損傷誘導(dǎo)基因34(growth arrest and DNA damage-inducible gene34,GADD34)在葡萄糖濃度20和30mM時出現(xiàn)顯著性升高;GRP78在20mM葡萄糖濃度處理72小時時升高。對于FLS,在30mM高糖處理24小時時,所有檢測的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志基因的表達明顯上調(diào),而當處理時間延長到48和72小時后,這些基因表達恢復(fù)至對照組水平。比較發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)FLS應(yīng)激的強度明顯大于對軟骨細胞的強度。②衣霉素誘導(dǎo)FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并出現(xiàn)類似高糖暴露的細胞損傷：與正常對照組相比,衣霉素處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志基因中腦星形膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-deriVed neurotrophic factor,MANF)和GADD34出現(xiàn)時間依賴性升高,在處理8和16小時時升高具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；MMP-3、MMP-13和ADAMTS5升高,同時TIMP-1也明顯升高；caspase-3禾□caspase-9在衣霉素處理16小時明顯升高,caspase-8則在4小時明顯升高,Bcl-2則呈時間依賴性降低,降低在8和16小時具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；此外,葡萄糖轉(zhuǎn)運體(Glucose transporter,GLUT)-1在8和16小時明顯升高,同時伴有iNOS的升高(P0.05)。③4-丁酸苯酯抑制高糖所致的FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細胞炎癥降解改變：與高糖對照組相比,4-丁酸苯酯處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志基因顯著降低(P0.01)；MMP-3明顯降低,但同時TIMP-1也明顯降低(P0.01),MMP-13和ADAMTS-5無明顯改變；caspase-3呈時間依賴性降低,且降低在處理16小時具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),抗凋亡基因Bcl-2升高,在4小時和8小時差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；此外,葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT-1在16小時明顯降低(P0.01)。 結(jié)論：高糖可誘導(dǎo)軟骨細胞和FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,且對FLS的影響更為顯著。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了高糖所致的FLS降解和凋亡等病理損傷。 綜上,糖尿病高血糖可誘導(dǎo)FLS內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而損傷滑膜,病變滑膜分泌炎癥和降解因子加劇高糖對關(guān)節(jié)軟骨的損害,使關(guān)節(jié)軟骨質(zhì)量下降,長距離跑步刺激下OA易感。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.1;R684.3

【參考文獻】

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1 張奉春;費允云;;老年骨關(guān)節(jié)炎的診治進展[J];實用老年醫(yī)學(xué);2008年01期

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本文編號：2568559