【摘要】：研究目的 肝細(xì)胞癌是最常見的惡性腫瘤之一,位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第六位、死亡率的第三位。盡管組織活檢被認(rèn)為是診斷肝細(xì)胞癌的金標(biāo)準(zhǔn),但是相對(duì)于血清生物標(biāo)志物檢測和影像學(xué)診斷技術(shù),組織活檢更具侵入性和創(chuàng)傷性。目前肝細(xì)胞癌的早期診斷主要依賴于血清甲胎蛋白檢測和肝臟影像學(xué)診斷技術(shù)如B超、CT、磁共振和PET-CT。但是臨床資料顯示,當(dāng)探查到異常時(shí),肝細(xì)胞癌往往已進(jìn)入中晚期,患者已出現(xiàn)臨床癥狀。因此目前臨床上迫切需要一種非侵入性的監(jiān)測技術(shù)早期診斷肝細(xì)胞癌。 分子影像整合了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)和影像診斷學(xué)技術(shù),可以非侵入性、實(shí)時(shí)監(jiān)測疾病發(fā)生發(fā)展,是目前最理想的非侵入性分子診斷技術(shù)。該技術(shù)成功實(shí)施主要依賴于特異性靶分子的發(fā)現(xiàn)和鑒定。盡管多項(xiàng)研究報(bào)道了分子影像診斷的靶分子的特征,但是迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)用于肝癌的早期診斷高效特異的靶分子。因此,尋找一種能早期特異性檢測腫瘤的靶向分子用于肝細(xì)胞癌分子影像學(xué)診斷已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn),也是臨床肝癌早期診斷的迫切需要。 最近報(bào)道血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)在許多類型腫瘤中高表達(dá)。AT1R通過升高血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),促進(jìn)腫瘤生長和血管生成。但是該分子是否在肝癌中表達(dá)尚不清楚。我們提出以下科學(xué)假說：肝細(xì)胞癌組織中AT1R表達(dá)顯著升高,131I-anti-AT1R mAb可能是一種潛在的新型肝癌分子顯像劑,有望用于肝癌的早期診斷。 研究方法 細(xì)胞培養(yǎng) 選擇小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞系H22、小鼠肝細(xì)胞系NCTC clone1469、人宮頸癌細(xì)胞系Hela和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12,用RPMI1640培養(yǎng)基(含100u/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清)、5%C02,37℃恒溫培養(yǎng),常規(guī)傳代。動(dòng)物模型 6～8周齡的雄性BALB/c小鼠購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在無病原體條件下飼養(yǎng)。通過右上背部注射1×107/0.1mL的H22細(xì)胞懸液建立小鼠肝細(xì)胞癌移植瘤模型。 anti-AT1R mAb和同型IgG的碘化標(biāo)記 選取50μg anti-AT1R mAb或同型IgG,分別用15μL Na131I(185MBq),通過lodogen法碘化標(biāo)記,Sephadex G-25凝膠柱分離標(biāo)記物。放化學(xué)純度和穩(wěn)定性 利用紙層析法測定放化學(xué)純度。分別將2μL131I-anti-AT1R mAb或131I-IgG加到400pL血清或鹽水中。取2pL混合液加到距層析紙下緣2cm,自然揮發(fā)干燥后,分別用丙酮或乙醇：水：氫氧化氨(2：5：1)展開。充分展開后,取出層析紙晾干,切成1cm寬的條帶,置于試管底部,用井型伽瑪計(jì)數(shù)儀測量。放射化學(xué)純度(%)=131I-anti-AT1R mAb或131I-IgG的放射性活性/總的放射性活性×100。在第1、6、24、48、72和96小時(shí)分別測量放化學(xué)純度以評(píng)價(jià)標(biāo)記物穩(wěn)定性。 放射性配體結(jié)合試驗(yàn) 放射性配體結(jié)合試驗(yàn)在高硼硅玻璃試管中進(jìn)行。飽和實(shí)驗(yàn)反應(yīng)混合液包括200NL的H22細(xì)胞(5x106/mL)和100pL梯度濃度(0.1～32nM)的131I-anti-AT1RmAb,用1xPBS補(bǔ)齊到500μL體積。10-1-105nM未標(biāo)記的anti-AT1R mAb和12nM131I-anti-AT1R mAb用于競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)�；旌弦�37℃下孵育2小時(shí),用細(xì)胞收集器分離結(jié)合的放射性配基,用Wipe Test/Well Counter測量結(jié)合的放射性配基的放射性活性。將飽和實(shí)驗(yàn)和競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行非線性回歸分析,計(jì)算平衡解離常數(shù)(KD)、最大結(jié)合量(Bmax)、抑制常數(shù)(Ki)和半數(shù)抑制濃度(IC50)。 全身放射自顯影 實(shí)驗(yàn)前3天飲水中加入10%KI封閉小鼠甲狀腺。注射H22細(xì)胞12天荷瘤鼠建立后,小鼠尾靜脈注射3.7MBq131I-anti-AT1R mAb或131I-IgG。分別于注射后的1、6、24、48和72小時(shí)行全身放射自顯影。將小鼠麻醉后仰臥位四肢伸展固定在磷屏上,確保腫瘤緊貼磷屏。磷屏曝光15分鐘后用Cyclone Plus Storage Phosphor System掃描并用OptiQuant Acquisition軟件分析。 131I-anti-AT1R mAb和31I-IgG的生物學(xué)分布 分別于注射后1、6、24、48和72小時(shí),每組處死6只小鼠,取血液、腫瘤、對(duì)側(cè)肌肉組織和主要器官,稱重,γ計(jì)數(shù)儀測量放射性活性,計(jì)算%ID/g和T/NT比值。藥代動(dòng)力學(xué)分析 分別于0、1、3、6、12、24、48、72、96和120小時(shí)于眶周靜脈取血10pL,用伽瑪計(jì)數(shù)儀測量放射性活性,計(jì)算分布半衰期(T1/2α)、消除半衰期(T1/2β)和平均停留時(shí)間(MRT)。實(shí)時(shí)定量PCR AT1R的引物序列為：有義鏈,5'-GAAGAACAAGCCAAGAAATGATG-3';反義鏈,5'-TTGATGACTCCAGGTTAGCAGAT-3'(887bp). Trizol一步法提取細(xì)胞或組織RNA,合成cDNA,聚合酶鏈反應(yīng)。擴(kuò)增條件：94℃變性4分鐘；94℃擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)30秒；55℃1分鐘；72℃1秒。利用2-△△cT法定量分析靶基因表達(dá)水平。組織學(xué)分析 標(biāo)本用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片。切片脫蠟,常規(guī)HE染色,檢測組織形態(tài)學(xué)變化；用anti-AT1R mAb免疫組化染色檢測AT1R的表達(dá)。Image-Pro Plus v5.0.2軟件定量分析AT1R蛋白的表達(dá)水平。Western blot 提取的H22腫瘤組織蛋白經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉,anti-AT1RmAb (1:400)孵育過夜,HRP標(biāo)記的二抗孵育2小時(shí),ECL化學(xué)發(fā)光液發(fā)光。β-actin (1:1000)作為內(nèi)參,HeLa細(xì)胞和PC12細(xì)胞作為陽性對(duì)照。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS v11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用one-way ANOVA.非配對(duì)或配對(duì)t檢驗(yàn)分析。P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 研究結(jié)果 anti-AT1R mAb和同型IgG的碘化標(biāo)記 131I-anti-AT1R mAb和131I-IgG的放化學(xué)純度分別為92.8%和93.2%,比活度分別為35.24±5.76MBq/μmol和38.61±7.18MBq/μmol。 131I-AT1尺mAb對(duì)AT1R的親和力 放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)是定量檢測標(biāo)記抗體對(duì)目標(biāo)受體親和力的最敏感的技術(shù)。本研究獲得的KD和Bmax分別為1.83±0.48nM和5361±345.3cpm,Ki和IC50分別為9.68±1.33nM和73.13±1.33nM。結(jié)果表明131I-AT1R mAb對(duì)AT1R有高親和力。 131I-AT1R mAb和131I-IgG的穩(wěn)定性 標(biāo)記物放置72小時(shí)后131I-anti-AT1R mAb和131I-IgG的放化學(xué)純度在血清中仍高于90%,在生理鹽水中下降到了80%以下,表明它們?cè)谘逯斜仍谏睇}水中更穩(wěn)定。同一環(huán)境下兩種顯像劑之間無明顯差異。荷肝細(xì)胞癌小鼠的全身放射性自顯影 注射碘化標(biāo)記的anti-AT1R mAb或同型IgG24小時(shí)后全身放射性自顯影圖像顯示,與131I-IgG組相比,131I-anti-AT1R mAb組的肝細(xì)胞癌顯像更清楚,這種差異在48小時(shí)達(dá)到最大。結(jié)果表明,131I-anti-AT1R mAb比131I-IgG更特異地靶向肝細(xì)胞癌。 131I-anti-AT1R mAb和131I-IgG的體內(nèi)生物學(xué)分布 131Ianti-AT1R mAb組腫瘤組織的%ID/g明顯高于其他組織,T/NT比值在注射48小時(shí)后達(dá)到高峰。131I-IgG組腫瘤組織的%ID/g無顯著增加,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中T/NT比值保持低水平。這些結(jié)果表明,肝癌組織比其他組織攝取更多的 131I-anti-AT1R mAb,而肝癌組織不選擇性地?cái)z取131I-IgG。因此,131I-anti-AT1RmAb可能是潛在的新型肝癌靶向顯像劑。藥代動(dòng)力學(xué)分析 藥代動(dòng)力學(xué)分析表明,131I-anti-AT1R mAb的藥代動(dòng)力學(xué)符合二室模型,包括快速分布期和緩慢清除期。T1/2a和T1/2β分別為5.7小時(shí)和156.7小時(shí),MRT為8.8小時(shí)。 ATiR mRNA和蛋白的表達(dá) H22細(xì)胞的mRNA水平明顯高于正常肝細(xì)胞。與之一致的是,肝細(xì)胞癌組織的AT1R mRNA水平也明顯高于對(duì)側(cè)肌肉和正常肝組織。AT1R蛋白主要定位于細(xì)胞膜。H22細(xì)胞的AT1R蛋白水平明顯高于正常肝細(xì)胞。與之一致,肝細(xì)胞癌組織的AT1R蛋白水平明顯高于對(duì)側(cè)肌肉和正常肝組織。此外,PC12細(xì)胞的AT1R蛋白水平高于H22和HeLa細(xì)胞。 研究結(jié)論 1、AT1R在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)。 2、肝細(xì)胞癌能特異性地?cái)z取131I-anti-AT1RmAb,因此有可能成為靶向肝細(xì)胞癌的潛在的分子顯像劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R735.7
【共引文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
2500155
