【摘要】：第—部分小腸旁路手術(shù)模型的建立及效果評價背景糖尿病(Diabetes Mellitus)是當今社會中嚴重威脅人類健康的疾病,它不僅帶來高致殘率與高病死率,而且造成巨大的經(jīng)濟消耗和社會負擔。根據(jù)流行病學資料,2013年,全球的糖尿病患者共約3.82億人,預計這一數(shù)字將于20年后超過5.9億。我國已有超過1億人受到糖尿病困擾,位居世界第一,且這一人數(shù)仍在不斷增加�？刂铺悄虿〖捌洳l(fā)癥刻不容緩。然而,傳統(tǒng)手段如控制飲食、運動、口服降糖藥物、胰島素治療等,并不能達到長期、滿意的血糖控制,也無法有效降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率。經(jīng)過研究人員對實驗動物的研究和對臨床病人的隨訪,“代謝手術(shù)”這一概念被越來越多的學者所接受,被認為是目前治療頑固性糖尿病的有效手段,已寫入糖尿病治療的臨床指南之中。目前最流行的代謝手術(shù)方式為Roux-en-Y式胃旁路術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass, RYGB)。RYGB療效確切,但其對技術(shù)操作要求高,并發(fā)癥發(fā)生率相對較高；其他手術(shù)方式也存在類似的問題。能否設計一種技術(shù)上更加簡單、安全的手術(shù)方式,依然是外科醫(yī)生的探索和追求。另外,RYGB等胃腸道代謝手術(shù)改善糖代謝的機制目前尚不明確,仍需要進一步研究。根據(jù)著名的“后腸假說”理論,食糜與末段回腸的快速接觸利于血糖的控制�；诖�,我們設計了一種新型的、簡單易行的小腸旁路手術(shù)模型,研究術(shù)后代謝指標的變化,判斷其安全性和有效性,并進一步借助其進行機制研究。這種手術(shù)方式此前未見于文獻報道。為了避免在名稱上與既往的“空回腸旁路術(shù)”(jejuno-ileal bypass)相混淆,我們根據(jù)其消化道重構(gòu)后的解剖特點,將此新型的小腸旁路手術(shù)方式命名為“空腸-回腸環(huán)路術(shù)”(jejuno-ileal circuit, JIC)。目的以糖尿病大鼠為研究對象,建立一種新型的小腸旁路手術(shù)模型(即JIC),綜合以下問題進行研究：(1)JIC的安全性和有效性；(2)與經(jīng)典手術(shù)方式——回腸轉(zhuǎn)位術(shù)(ileal interposition, I T)進行對比,進一步驗證其對糖尿病的改善作用；(3)研究不同距離的食糜傳輸對于血糖改善作用的影響。方法以高脂飲食(high-fat diet diet, HFD)喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量(30mg/kg)鏈脲佐霉素(streptozotocin, STZ)注射,誘導12周齡的雄性Wistar大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗及非肥胖型糖尿病。糖尿病大鼠隨機分為以下五組：(1)短空腸段的JIC組(JIC-short jejunum, JIC-S):距離屈氏韌帶(Treitz) 5 cm處的空腸與遠端回腸進行吻合；(2)長空腸段的JIC組(JIC-long jejunum, JIC-L)：距離Treitz韌帶20 cm處的空腸與遠端回腸進行吻合；(3)JIC假手術(shù)組(Sham-JIC):開腹后像JIC手術(shù)一樣進行腸道的暴露和探查,而并不改變腸道的解剖：(4)IT組：行IT手術(shù),將10 cm長的末端回腸轉(zhuǎn)位至距離Treitz韌帶10 cm處；(5)IT假手術(shù)組(Sham-IT):同IT般切斷相應腸道,然后實施原位吻合。假手術(shù)組的手術(shù)時間延長至與手術(shù)組一致,以保證相同程度的麻醉影響和體液丟失。手術(shù)后觀察實驗動物的并發(fā)癥發(fā)生情況及存活率,并檢測如下指標：(1)體重、進食量、飲水量；(2)隨機血糖(非空腹)：每周3次；(3)葡萄糖耐量：在術(shù)前及術(shù)后第2、4、8、12周進行口服葡萄糖糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT);(4)胰島素耐量：術(shù)前及術(shù)后第4、12周進行胰島素耐量試驗(insulin tolerance test, ITT); (5)血清學指標：術(shù)后第4、12周采空腹血,檢測肝腎功能指標及胰島素水平；(6)評估胰島素抵抗：術(shù)后第4、12周以“穩(wěn)態(tài)模型”評價胰島素抵抗(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR).結(jié)果1.與IT手術(shù)相比,JIC手術(shù)時間更短；JIC手術(shù)后無出血、吻合口漏、梗阻、營養(yǎng)不良等并發(fā)癥發(fā)生。2.JIC手術(shù)并未改變實驗動物的體重和進食量。術(shù)后JIC-S組和IT組飲水量下降,這與血糖改善的趨勢一致。3.與假手術(shù)相比,JIC-S和IT術(shù)后12周肝腎功均有改善。4.相比于假手術(shù)組,JIC-S、IT術(shù)后空腹胰島素分泌量增加。5.JIC-S術(shù)后血糖代謝明顯改善,具體表現(xiàn)為隨機血糖降低、糖耐量及胰島素耐量改善、胰島素抵抗減輕。其效果與IT效果相當。6.JIC-L并不能達到JIC-S對糖尿病的改善效果。結(jié)論1.作為新型的小腸旁路手術(shù)模型,JIC-S操作簡單,安全性高。2.JIC-S對糖尿病大鼠的肝腎功、血糖穩(wěn)態(tài),胰島素分泌及敏感性均有改善作用,效果與IT相似。這種改善作用并不伴隨體重變化。3.相比JIC-S, JIC-L術(shù)式延長了食糜的傳輸距離,延緩了營養(yǎng)物質(zhì)與遠端小腸的接觸,其對于胰島素抵抗和糖代謝并無明顯改善作用。這與“后腸假說”理論一致。4.JIC-S是理想的試驗性手術(shù)方式。其改善糖尿病的機制將在下一部分進行探討。第二部分空腸-回腸環(huán)路術(shù)改善葡萄糖代謝的機制研究背景胃腸道代謝手術(shù)(有時也被籠統(tǒng)稱為“減重手術(shù)”)能夠快速、持久地改善胰島素抵抗、緩解糖尿病,但機制尚不明確。體重下降并非主要原因,因為血糖的改善往往早于體重的減輕,而且某些手術(shù)方式并未明顯影響體重卻仍可達到降糖效果。目前一般認為,代謝手術(shù)后糖代謝的改善包括體重依賴性和非體重依賴性兩方面機制,在術(shù)后早期以后者為主。探尋不依賴于體重的具體機制一直是研究者們努力的方向。研究表明,小腸在代謝改善的過程中發(fā)揮重要作用,相關機制的推測主要有“前腸假說(近端小腸假說)”和“后腸假說(遠端小腸假說)”,但目前尚未形成統(tǒng)一理論。為了更好地研究小腸在術(shù)后血糖改善中發(fā)揮的不依賴減重的作用,本實驗以非肥胖型糖尿病大鼠為研究對象,設計了JIC手術(shù)方式,并聯(lián)合IT進行研究。從解剖特點上看,JIC和IT都只改變了小腸的解剖,而保持了胃和幽門的完整性,適合研究小腸尤其是遠端小腸的作用。課題的第一部分已經(jīng)證實了JIC-S的安全性和有效性,而在本部分,我們將主要從食糜傳輸、腸道激素等方面探討術(shù)后血糖改善的機制。此外,肝臟對葡萄糖的利用以及糖異生過程也對血糖的平衡產(chǎn)生影響,此方面的相關指標本研究也有涉及。目的以腸道相關因素的變化為切入點,探討空腸-回腸環(huán)路術(shù)后血糖改善的相關機制。方法以第一部分的實驗動物作為研究對象,檢測下述指標并進行組間對比：(1)術(shù)后第4、12周采血,檢測胰島素濃度；(2)檢測術(shù)后第4、12周血清中胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide 1, GLP-1)、多肽YY (peptide YY,PYY)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependent insulinotropic peptide, GIP)等腸道激素水平；(3)術(shù)后12周取肝臟標本,以聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)測定葡萄糖轉(zhuǎn)運體2的信使RNA水平(glucose transporter 2 messenger RNA, GLUT2 mRNA);(4)以蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting, WB)方法檢測肝臟糖異生關鍵酶：葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6P)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PCK)水平；(5)大鼠處死前灌注染料,借此測量腸道內(nèi)食糜的傳輸速度。結(jié)果1.術(shù)后4周及12周,JIC-S組和IT組胰島素水平明顯高于其他各組,且二者水平相近。2.相比于其他組,術(shù)后JIC-S組和IT組的GLP-1、YY濃度均升高；JIC-S和IT組之間無差別。GIP水平各組之間保持一致。3.術(shù)后12周,JIC-S組和IT組在肝臟GLUT2 mRNA的表達上高于其他三組。4.WB顯示,術(shù)后12周肝臟的G6P和PCK水平在JIC-S和IT組顯著下降。5.術(shù)后12周染料在大鼠腸道內(nèi)的推進情況顯示,在JIC-S組和IT組,食糜均快速接觸了遠端回腸。結(jié)論1.JIC-S和IT術(shù)后胰島素水平升高,利于高血糖的控制。2.GLP-1和PYY的升高,是JIC-S和IT術(shù)后葡萄糖糖穩(wěn)態(tài)好轉(zhuǎn)的重要原因。3.JIC-S和IT術(shù)后肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達上調(diào),提示肝臟攝取葡萄糖能力增強；而肝臟糖異生關鍵酶的表達下調(diào),提示糖異生過程受抑制,肝糖輸出減少。這些變化均有益于糖尿病的好轉(zhuǎn)。4.上述因素的變化,推測是由于JIC-S以及IT手術(shù)后食糜快速接觸了遠端回腸所致。這與“后腸假說”內(nèi)容一致。第三部分空腸-回腸環(huán)路術(shù)對脂代謝異常的改善作用背景脂質(zhì)代謝異常,也稱為脂質(zhì)代謝紊亂(lipid dysmetabolism),是血液及其他組織器官中脂質(zhì)及其代謝產(chǎn)物質(zhì)和量的異常,包括血脂異常、非酒精性脂肪肝等。脂質(zhì)代謝異常顯著增加心血管疾病、肝臟疾病等風險,威脅人類健康。脂質(zhì)代謝紊亂并非一種獨立疾病,而是與胰島素抵抗和葡萄糖代謝異常互為因果,并共同參與代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展。有文獻證明,糖尿病患者更容易發(fā)生脂質(zhì)代謝異常,反之亦然。對于脂質(zhì)代謝紊亂,尤其是非酒精性脂肪肝,過去缺乏行之有效的治療手段。胃腸道代謝手術(shù)的興起為之提供了新的希望,目前已有許多文獻證實,RYGB、IT、袖狀胃切除術(shù)(sleeve gastrectomy,SG)、十二指腸空腸旁路術(shù)(duodenal-jejunal bypass, DJB)以及膽胰轉(zhuǎn)流術(shù)(biliopancreatic diversion, BPD)均有改善脂質(zhì)代謝的作用。胃腸道代謝手術(shù)已成為治療脂質(zhì)代謝異常的重要手段,然而對于術(shù)后高血脂或脂肪肝恢復的原因和機制,目前尚缺乏定論。在前面的實驗中,我們證實了JIC-S對糖尿病大鼠血糖的改善作用,然而,這種新型手術(shù)方式是否同樣可以改善脂質(zhì)代謝,尚需進一步研究。根據(jù)本研究的前兩部分,JIC-S能夠有效改善糖尿病大鼠的肝功水平及胰島素敏感性。鑒于胰島素敏感性的恢復有利于脂質(zhì)代謝的改善,而肝功的好轉(zhuǎn)可能意味著脂肪肝的改善,我們推測,JIC-S對脂質(zhì)代謝異常有治療作用。為了證實這一推測,在這一部分,我們從血脂、脂肪因子、肝臟脂肪聚集情況等方面進行檢測,研究JIC-S術(shù)后脂質(zhì)代謝的變化及機制�？紤]到脂質(zhì)代謝與糖代謝的相互影響,術(shù)后脂質(zhì)代謝的改善也可能是手術(shù)后糖尿病好轉(zhuǎn)的原因之一。根據(jù)前兩部分實驗,JIC-S對糖尿病有治療作用而JIC-L沒有,因此本部分并不涉及JIC-L手術(shù),僅以JIC-S作為空腸-回腸環(huán)路手術(shù)的代表。目的以非肥胖型糖尿病大鼠為研究對象,研究JIC手術(shù)(即前兩部分所述的JIC-S)改善脂質(zhì)代謝的作用及相關機制。方法以文獻報道為依據(jù),以HFD長期喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射,誘導13周齡的雄性Wistar大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗及非肥胖型糖尿病,同時伴有肝臟脂肪堆積的發(fā)生。糖尿病大鼠隨機分為JIC組及Sham-JIC組。JIC的手術(shù)方式與本實驗第部分中關于JIC-S的描述一致；Sham組則實施相同位置的腸切開術(shù),但并不像JIC一樣進行遠近端的吻合,而是原位縫合。手術(shù)后記錄實驗動物的并發(fā)癥情況及存活率,并檢測如下指標：(1)體重、進食量；(2)OGTT-在術(shù)前及術(shù)后第4、12周進行；(3)ITT：術(shù)前及術(shù)后第4、12周進行；(4)丙酮酸耐量試驗(Pyruvate Tolerance Test, PTT):術(shù)前及術(shù)后第4、12周進行；(5)血清學指標：術(shù)后第4、12周采血,檢測甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸和總膽汁酸水平；(6)激素水平：術(shù)后第4、12周采血,分別檢測GLP-1、瘦素及脂聯(lián)素水平；(7)術(shù)后12周處死大鼠,取肝臟標本,以WB方法檢測肝臟脂肪生成的關鍵酶：脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)及乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC);(8)取肝臟標本,分別進行HE染色和油紅O染色,判斷其脂肪聚集情況；(9)術(shù)后12周取大鼠回腸標本,對腸內(nèi)分泌細胞及其分泌的GLP-1進行免疫組化染色; (10)術(shù)后12周取大鼠糞便標本,檢測腸道菌群中擬桿菌和厚壁菌門的含量。結(jié)果1.整個實驗期間兩組的體重和進食量均無明顯差別。2.相比于假手術(shù),JIC術(shù)后OGTT, ITT和PTT均有顯著改善。3.手術(shù)后JIC組的大鼠較sham組大鼠有更低的血清甘油三酯和游離脂肪酸水平,而膽固醇水平并無明顯差別。4.手術(shù)后12周,JIC組的血清總膽汁酸水平升高。5.JIC術(shù)后血清中的和腸道分泌的GLP-1水平均升高。6.JIC術(shù)后12周,血清瘦素水平下降,而脂聯(lián)素濃度升高。7.術(shù)后12周WB結(jié)果提示JIC組肝臟FAS及ACC表達均下降。8.HE染色及油紅O染色均提示JIC術(shù)后肝臟脂肪變的程度緩解。9.術(shù)后12周,與sham組相比,JIC組腸道菌群中擬桿菌所占比例升高,而厚壁菌門比例無明顯差別。結(jié)論1.JIC發(fā)揮了不依賴體重的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用,對血脂升高和肝臟脂肪變性均有改善效果。2.JIC改善了胰島素抵抗,這與脂質(zhì)代謝的好轉(zhuǎn)密切相關。3.GLP-1的升高、脂肪因子的變化、血清膽汁酸水平的升高以及腸道菌群的改變,可能是胰島素敏感性恢復和脂質(zhì)代謝好轉(zhuǎn)的原因。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R656.7;R587.1
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本文編號：2465273