【摘要】：研究目的 椎間盤細胞生活在一個低氧的微環(huán)境中，低氧張力是調(diào)節(jié)髓核細胞增殖分化和細胞外基質(zhì)合成的重要因素。Notch信號通路是一個對低氧敏感、調(diào)節(jié)細胞增殖分化的重要信號通路，為闡明椎間盤中低氧環(huán)境和Notch信號通路參與調(diào)節(jié)髓核細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成的可能機制，我們擬通過實驗明確以下幾個問題：①不同氧濃度培養(yǎng)對大鼠髓核細胞細胞增殖、細胞周期、表型表達等的影響，Notch信號抑制劑對髓核細胞增殖的影響；②不同濃度低氧模擬類似物去鐵胺干預髓核細胞對髓核細胞增殖、細胞周期、表型表達等的影響；③比較不同氧濃度和去鐵胺干預條件下大鼠髓核細胞Notch通路相關靶基因和HIF-α的表達情況，初步闡明氧濃度和去鐵胺促進髓核細胞增殖的可能機制。 研究內(nèi)容 ①取4只3周齡SD大鼠（體重200至220克左右），2.5%戊巴比妥麻醉，脊柱區(qū)皮膚備皮，無菌條件下取出腰段脊柱，分離獲得Uk喱狀髓核組織，，0.2%II型膠原酶消化，將獲得的髓核細胞進行原代培養(yǎng)。實驗中采用第三代髓核細胞，進行相關染色，免疫細胞化學和半定量PCR方法鑒定髓核細胞表型。將髓核細胞分別置于常氧（21%O2）和低氧（1%O2）條件下培養(yǎng)8至24小時，通過CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測細胞增殖情況，通過流式細胞儀檢測細胞周期變化情況；運用Notch信號通路抑制劑干預髓核細胞，CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期變化，通過Real-time PCR檢測不同氧濃度干預下髓核細胞表型表達變化。 ②運用不同濃度去鐵胺（25umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L）干預髓核細胞，通過CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期變化，通過Real-time PCR檢測適當濃度去鐵胺對髓核細胞表型表達的影響。 ③將髓核細胞分別置于常氧、低氧及去鐵胺干預條件下培養(yǎng)8至48小時，通過Real-time PCR、Western-blot檢測不同培養(yǎng)條件下Notch信號通路相關分子及HIF-α的表達情況，初步探討氧濃度及去鐵胺影響髓核細胞增殖的可能機制。 結(jié)果 ①CCK-8結(jié)果顯示：與常氧培養(yǎng)相比，髓核細胞在低氧培養(yǎng)時所測OD值明顯升高；無論在常氧或低氧培養(yǎng)條件下，加入Notch抑制劑干預后所測OD值明顯降低；流式細胞儀結(jié)果顯示：與常氧培養(yǎng)相比，髓核細胞在低氧培養(yǎng)時處于S期細胞所占百分率明顯升高，加入Notch抑制劑干預后處于S期細胞所占百分率明顯降低；低氧干預后，髓核細胞COL2A1、Aggrecan、Sox-9、COL1A1mRNA表達水平都有不同程度升高。 ②CCK-8結(jié)果顯示：25umol/L、50umol/L去鐵胺干預髓核細胞時，OD值明顯升高，200umol/L去鐵胺干預時，OD值明顯下降，而100umol/L去鐵胺干預時，OD值與對照組相比無明顯差異；流式細胞儀結(jié)果顯示：50umol/L去鐵胺干預時，處于S期細胞所占百分比都有增加，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義；50umol/L DFO干預髓核細胞后COL2A1、Aggrecan mRNA表達升高，Sox-9mRNA表達水平下降，COL1A1mRNA無明顯變化。 ③髓核細胞在低氧培養(yǎng)8~24小時后，Notch靶基因Hes1、Hes5、Hes7mRNA都有不同程度上調(diào)，Hey1、Hey2mRNA表達水平下調(diào)；Hes1、Hes7蛋白在低氧干預24~48小時后表達上升，而Hes5表達水平無明顯變化；低氧干預24~48小時后HIF-1αmRNA和蛋白質(zhì)水平都有明顯上調(diào)，HIF-2α表達無明顯變化。50umol/L去鐵胺干預后,髓核細胞Notch信號通路靶基因Hes1、Hes7、Hey1mRNA表達都有不同程度下降，Hes7蛋白表達水平下降，Hes5表達水平無明顯變化；去鐵胺干預后HIF-1α和HIF-2α表達水平都有不同程度升高。 結(jié)論 ①體外低氧微環(huán)境可以促進髓核細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成； ②體外低氧微環(huán)境可以通過上調(diào)Notch信號靶基因的表達水平來促進髓核細胞增殖，Notch信號相關靶基因可以作為研究靶點，用于體外調(diào)控髓核細胞增殖分化的過程； ③體外適當濃度去鐵胺可以促進髓核細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成，去鐵胺可能通過上調(diào)HIF-1α/HIF-2α的方式參與調(diào)節(jié)髓核細胞增殖的過程，去鐵胺可能作為一種治療藥物用于延緩椎間盤退變的過程。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R681.53

【參考文獻】

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1 劉勇,胡有谷,呂振華;腰椎間盤細胞的培養(yǎng)及形態(tài)學觀察[J];中華醫(yī)學雜志;1999年02期

本文編號：2416070