【摘要】：目的優(yōu)化靈芝中性三萜組分的提取純化工藝,建立靈芝中性三萜組分的質(zhì)量控制方法,通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)靈芝中性三萜組分的抗腫瘤活性,并對(duì)其安全性進(jìn)行初步研究,為靈芝三萜抗腫瘤新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法1.靈芝中性三萜組分的提取純化(1)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn),優(yōu)化靈芝總?cè)频奶崛」に嚒?2)應(yīng)用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,對(duì)靈芝中性三萜組分進(jìn)行富集純化。2.靈芝中性三萜組分質(zhì)量控制的初步研究(1)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法(UV-vis)建立靈芝中性三萜組分中總?cè)频暮繙y(cè)定方法。(2)運(yùn)用反相高效液相色譜(RP-HPLC)技術(shù),初步建立靈芝中性三萜組分的HPLC指紋圖譜。3.靈芝中性三萜組分體內(nèi)外抗腫瘤活性的研究(1)采用MTT法體外檢測(cè)兩種不同方法(溶劑法和樹(shù)脂法)制備的靈芝中性三萜組分對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562、人髓系-白血病細(xì)胞株HL60生長(zhǎng)的抑制作用。(2)采用溶劑--熔融法,建立靈芝中性三萜固體分散體的制備方法。(3)分別建立小鼠H22和S180實(shí)體瘤以及腹水瘤的模型,觀察靈芝中性三萜組分對(duì)這兩種瘤株的抑瘤率(實(shí)體瘤)和生命延長(zhǎng)率(腹水瘤)的影響,評(píng)價(jià)靈芝中性三萜組分體內(nèi)抗腫瘤活性。4.靈芝中性三萜組分的一般藥理學(xué)研究分別通過(guò)曠野法、金屬棒法和傾斜板法,觀察靈芝中性三萜固體分散體對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)及機(jī)能協(xié)調(diào)功能的影響;根據(jù)入睡率和睡眠時(shí)間來(lái)判斷靈芝中性三萜固體分散體與戊巴比妥鈉聯(lián)用對(duì)小鼠的睡眠等神經(jīng)系統(tǒng)方面的影響;使用生理機(jī)能記錄儀記錄給藥前后靈芝中性三萜固體分散體對(duì)麻醉大鼠的呼吸頻率、血壓、心率等呼吸、心血管系統(tǒng)方面的影響。結(jié)果1.靈芝中性三萜組分的提取純化(1)通過(guò)正交試驗(yàn)篩選及考慮生產(chǎn)成本等因素,選定回流提取法最優(yōu)條件為:6倍量95%乙醇提取3次,每次1.5 h。(2)使用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)靈芝中性三萜組分進(jìn)行富集純化,以1 BV/h的流速上樣,樹(shù)脂徑高比為1:10,按照上樣液體積與樹(shù)脂體積比為4:1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附(上樣液1 ml相當(dāng)于原生藥0.35 g),水洗至無(wú)色后,依次用4倍樹(shù)脂柱體積的飽和Na HCO3水溶液、水、60%和95%乙醇洗脫,洗脫流速為2BV/h,收集95%乙醇洗脫液,濃縮真空干燥即得。2.靈芝中性三萜組分質(zhì)量控制的初步研究(1)采用UV-vis,建立了靈芝中性三萜組分中總?cè)频暮繙y(cè)定方法。(2)靈芝中性三萜組分的指紋圖譜中可標(biāo)定11個(gè)特征明顯的共有峰,指紋圖譜分離效果理想。3.靈芝中性三萜組分體內(nèi)外抗腫瘤活性的研究(1)兩種不同方法制備的靈芝中性三萜對(duì)K562和HL60細(xì)胞的增殖均有抑制作用,樹(shù)脂法和溶劑法靈芝中性三萜作用于K562細(xì)胞48 h的IC50值分別是120.36μg/ml和149.36μg/ml,作用于HL60細(xì)胞48 h的IC50值分別是30.63μg/ml和24.49μg/ml。(2)采用溶劑-熔融法,以F68和44/14為載體(1:1),按藥物與載體的比例為1:8制備靈芝中性三萜組分的固體分散體,從而改善三萜組分的水溶性。(3)靈芝中性三萜固體分散體的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有顯著抑制H22和S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用(P0.05),500 mg/kg組的抑瘤率分別為55.73%和53.58%;溶劑法制備的靈芝中性三萜固體分散體亦能顯著抑制H22、S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)(P0.05),但其500 mg/kg劑量的抑瘤率分別為21.22%和31.61%;非制備成固體分散體的靈芝中性三萜CMC-Na混懸液對(duì)H22、S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)也有顯著的抑制作用(P0.01),其500 mg/kg劑量的抑瘤率分別為28.28%和23.31%;靈芝中性三萜固體分散體的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均能延長(zhǎng)H22、S180腹水瘤小鼠的存活時(shí)間,且以中、高劑量組的生命延長(zhǎng)率較為顯著(P0.05),500mg/kg組的生命延長(zhǎng)率分別為35.4%和43.4%;溶劑法靈芝中性三萜固體分散體亦能顯著延長(zhǎng)H22、S180腹水瘤小鼠的生存時(shí)間(P0.05),500 mg/kg組的生命延長(zhǎng)率分別為27.1%和32.8%;中性三萜CMC-Na混懸組能延長(zhǎng)H22腹水瘤小鼠的生存時(shí)間,但對(duì)S180腹水瘤小鼠的生存時(shí)間的延長(zhǎng)作用更為顯著(P0.05),500mg/kg組的生命延長(zhǎng)率分別為15.1%和20.5%。4.靈芝中性三萜組分的一般藥理學(xué)研究靈芝中性三萜固體分散體(250~1000 mg/kg)對(duì)小鼠的自主活動(dòng)、機(jī)能協(xié)調(diào)功能、戊巴比妥鈉閾下催眠劑量及戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間均沒(méi)有明顯的影響;對(duì)麻醉大鼠的呼吸和心血管系統(tǒng)無(wú)影響(125~500 mg/kg)。結(jié)論1.靈芝中性三萜組分的提取純化(1)經(jīng)優(yōu)化的提取方法,穩(wěn)定可行,可用于靈芝總?cè)频奶崛　?2)AB-8型大孔樹(shù)脂吸附洗脫法具有選擇吸附性強(qiáng),富集效果理想,解吸條件較溫和等優(yōu)點(diǎn),可用于靈芝中性三萜組分的富集純化。2.靈芝中性三萜組分質(zhì)量控制的初步研究(1)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法建立的靈芝中性三萜組分的含量測(cè)定方法,該方法經(jīng)典穩(wěn)定,可作為靈芝中性三萜組分質(zhì)量控制中的定量控制方法。(2)采用RP-HPLC法建立的靈芝中性三萜組分的指紋圖譜,該方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好,可用于靈芝中性三萜組分的定性質(zhì)量控制。3.靈芝中性三萜組分體內(nèi)外抗腫瘤活性的研究(1)兩種靈芝中性三萜對(duì)K562和HL60細(xì)胞均有抑制增殖作用,表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系,且這兩種不同方法制備的靈芝中性三萜在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用差別不大。(2)以F68和44/14為載體,采用溶劑-熔融法制備固體分散體,能提高靈芝三萜的分散性,改善靈芝三萜的水溶性,有望提高靈芝中性三萜組分的生物利用度。(3)靈芝中性三萜固體分散體對(duì)H22和S180這兩種小鼠的瘤細(xì)胞不論是實(shí)體瘤還是腹水瘤,都有較強(qiáng)的活性;將靈芝中性三萜組分制備成固體分散體后抗腫瘤活性增加,提高了生物利用度;樹(shù)脂法靈芝中性三萜的體內(nèi)活性高于相同劑量的溶劑法靈芝中性三萜的體內(nèi)活性,這也驗(yàn)證了大孔樹(shù)脂吸附法用于靈芝中性三萜組分富集和純化的可行性和優(yōu)越性。4.靈芝中性三萜組分的一般藥理學(xué)研究靈芝中性三萜固體分散體對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的影響較小,在藥效學(xué)有效劑量范圍內(nèi)安全性較高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2381310