【摘要】：【背景】天麻為蘭科屬植物,其塊莖可以入藥。中醫(yī)認為,天麻性味甘、平,入肝經(jīng)。具有息風(fēng)、定驚的功效,可用于治療眩暈眼黑,頭風(fēng)頭痛,肢體麻木,半身不遂,語言蹇澀,小兒驚癇動風(fēng)。近來的藥理學(xué)研究顯示,天麻具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、止痛、益智和抗炎作用,還可以改善循環(huán),可以用于治療多種心血管疾病,包括偏頭痛、癲癇和抑郁癥。作為其主要藥學(xué)成分,天麻素已被發(fā)現(xiàn)可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對小膠質(zhì)細胞抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2)和促炎性細胞因子細胞因子表達的上調(diào)作用,我們的已往研究也發(fā)現(xiàn)天麻素可以改善增強單次延長應(yīng)激(enhanced single prolonged stress,ESPS)所致大鼠的焦慮樣行為,而且這一作用與其降低海馬IL-6、IL-1β水平,抑制iNOS表達和p38 MAPK磷酸化水平有關(guān)。此外,最近的研究表明,天麻素也具有抗氧化作用[16],其可以通過激活ERK2/1-Nrf2通路,上調(diào)過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶的活性(SOD),抑制原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元對β-淀粉樣肽誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。因此,天麻素也可能通過抑制炎癥相關(guān)通路上調(diào)機體的抗氧化水平從而維持大腦結(jié)構(gòu)和功能的完整性以發(fā)揮其抗抑郁和神經(jīng)保護作用。【目的】1.觀察天麻素對慢性不可預(yù)見應(yīng)激(cus)大鼠抑郁樣行為的改善作用及對海馬和海馬星形膠質(zhì)細胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)表達的影響。2.觀察天麻素的抗炎效應(yīng)以及其對抑郁樣行為和海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響。3.觀察天麻素對腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)保護作用研究。【方法】1.構(gòu)建抑郁大鼠模型,給予不同劑量的天麻素干預(yù),持續(xù)2周。隨后,通過強迫游泳實驗和糖水偏好實驗檢測各組大鼠的抑郁樣行為,在行為學(xué)檢測結(jié)束后,處死大鼠,通過免疫組化和westernblot檢測大鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(gfap)和bdnf的表達情況。通過原代培養(yǎng)獲得海馬星形膠質(zhì)細胞,給予不同劑量天麻素(sham、5、10、20、50和100μg/ml)48或72小時后,觀察天麻素對星形膠質(zhì)細胞活力、erk磷酸化和bdnf水平的作用,并通過去血清培養(yǎng),觀察不同劑量天麻素對星形膠質(zhì)細胞的保護作用。2.大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)10天:自由攝食和飲水,飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫恒濕,通過燈光調(diào)節(jié)晝夜轉(zhuǎn)換循環(huán)(12:12小時)。隨后,大鼠隨機分為對照組(sham),對照+低劑量天麻素組(50mg/kg)、對照+中劑量天麻素組(100mg/kg)、對照+高劑量組天麻素組(200mg/kg)以及模型組(cus),模型+天麻素低、中、高劑量組(50、100或者200mg/kg),每組12只。對照組以及對照+不同劑量天麻素組不進行cus造模,但是每天腹腔注射生理鹽水或者不同劑量天麻素,連續(xù)14天;模型組以及模型+不同劑量天麻素組進行cus造模,并且在造模結(jié)束后,每天腹腔注射生理鹽水或不同劑量的天麻素(50、100或者200mg/kg),持續(xù)14天。各處理腹腔注射生理鹽水或者天麻素的時間均為上午9:00至10:00。隨后,每組大鼠中的一部分(n=8)進行曠場實驗和強迫游泳實驗,在行為學(xué)測試后處死大鼠,通過免疫組化和westernblot、elisa檢測大鼠海馬細胞增殖情況,蛋白表達和il-1β釋放水平。其余部分大鼠(n=4)用于morris水迷宮測試。在造模每周末以及天麻素干預(yù)結(jié)束后測量體重。離體實驗:對離體培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞添加不同劑量的天麻素(0、5、10、20、50μg/ml),作用3天或5天后,觀察細胞活力。此外,在細胞克隆球的細胞培養(yǎng)體系加入終濃度為10ng/ml的il-1β,作用2小時后再加入不同劑量的天麻素,作用24或48小時后,通過brdu染色和細胞活力測試觀察天麻素的保護作用。3.小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)10天后,機分為以下5組:對照組(sham),模型組(mcao+vehicle),模型+天麻素低、中、高劑量組,即mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)。對照組和模型組在實驗過程中腹腔注射生理鹽水,mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)則分別注射10、50和100mg/kg體質(zhì)量的生理鹽水,注射液體量為0.1ml/kg體質(zhì)量。(1)為了觀察天麻素對mcao損傷的保護作用,sham組行假手術(shù):水合氯醛麻醉后,取右頸部切口,逐層分離肌肉暴露右側(cè)頸總動脈。1小時后腹腔注射生理鹽水,縫合創(chuàng)口。mcao+vehicle組經(jīng)mcao干預(yù)1小時后,腹腔注射生理鹽水,拔出線栓,縫合創(chuàng)口。mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)與mcao組干預(yù)方式相似,但是注射了不同劑量的天麻素。在缺血24小時后進行神經(jīng)功能評分,隨后處死動物,取部分小鼠的缺血側(cè)半腦進行westernblot或mda和sod檢測,其余小鼠灌注固定后,取大腦冰凍切片,進行nissl染色。(2)為了觀察天麻素在mcao延遲期的作用,sham組假手術(shù)1小時后,腹腔注射生理鹽水,縫合創(chuàng)口,并在隨后的6天,同一時間點注射等劑量的生理鹽水。mcao+vehicle組的干預(yù)方式與sham組相似,但是經(jīng)mcao造成缺血再灌注。mcao+gas(l)、mcao+gas(m)和mcao+gas(h)與mcao組干預(yù)方式相似,但是注射了不同劑量的天麻素。在最后一次注射生理鹽水或天麻素24小時后,對各處理組小鼠進行神經(jīng)功能評分,隨后處死動物,取部分小鼠的缺血側(cè)半腦進行westernblot或mda和sod檢測,其余小鼠灌注固定后,取大腦冰凍切片,進行nissl染色。(3)為了觀察天麻素對mcao急性期所致氧化應(yīng)激和炎癥水平的抑制作用,5組小鼠造模和給藥方式同3.1,但不同的是在缺血6小時后再進行相關(guān)指標的檢測。【結(jié)果】(1)慢性不可預(yù)見應(yīng)激(cus)可以導(dǎo)致明顯的抑郁樣行為,包括糖水偏好減少和強迫游泳不動時間增加,cus還顯著抑制了海馬gfap和bdnf的表達水平。而一定劑量(100和200mg/kg)天麻素慢性干預(yù)可以緩解上述情況。此外,天麻素直接干預(yù)并不影響海馬星形膠質(zhì)細胞活力,但是20μg/ml劑量條件下對去血清損傷有一定的保護作用,對星形膠質(zhì)細胞ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF的表達具有調(diào)節(jié)作用。(2)天麻素緩解CUS所致大鼠體重減輕,但是對運動能力沒有顯著作用。天麻素緩解CUS所致大鼠抑郁樣行為和空間記憶損傷,抑制了CUS所致大鼠血漿IL-1β和IL-6水平和海馬炎性通路的表達水平上調(diào),還可以上調(diào)海馬BDNF和GDNF的表達水平和海馬的增殖。此外,天麻素直接干預(yù)并不影響海馬神經(jīng)干細胞活力,但是10μg/ml和20μg/mll劑量條件下對IL-1β所致細胞活力損傷有一定的保護作用。(3)天麻素干預(yù)(50和100 mg/Kg)減少了MCAO所致小鼠急性期及延遲期腦梗死容積,并且改善其神經(jīng)功能評分;緩解了MCAO所致小鼠大腦的形態(tài)學(xué)損傷并抑制了大腦的凋亡相關(guān)蛋白的表達,此外,上述劑量條件下的天麻素干預(yù)抑制了MCAO所致小鼠急性期大腦氧化應(yīng)激水平,并且抑制了促炎性細胞因子的表達情況�！窘Y(jié)論】1.一定劑量的天麻素對CUS所致抑郁樣行為具有改善作用,這一作用可能與天麻素維持海馬星形膠質(zhì)細胞的活性,上調(diào)ERK1/2磷酸化和BDNF的表達水平有關(guān)。2.天麻素對抑郁樣行為的改善作用可能與其抑制促炎性細胞因子水平,抑制炎癥相關(guān)通路,改善海馬神經(jīng)發(fā)生和維持神經(jīng)干細胞活性有關(guān)。3.天麻素通過其抗炎和抗氧化作用,對缺血性腦損傷具有保護作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285

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本文編號：2355744