【摘要】：急性脊髓損傷是嚴(yán)重致殘性疾病,可導(dǎo)致患者的運動功能障礙,嚴(yán)重的后遺癥和并發(fā)癥給患者個人和家庭以及社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。急性脊髓損傷包括原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。繼發(fā)性脊髓損傷導(dǎo)致原發(fā)性脊髓損傷對脊髓的傷害進(jìn)一步加劇,但這個過程又是具有可逆性和可調(diào)控性的,因此對繼發(fā)性脊髓損傷的轉(zhuǎn)歸對脊髓神經(jīng)的修復(fù)和再生具有非常重要的價值和意義。目前,對急性脊髓損傷治療的關(guān)鍵點集中在繼發(fā)性脊髓損傷病理反應(yīng)和機(jī)制的研究。自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出的,是胞內(nèi)形成雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。在脊髓損傷中,神經(jīng)元作為終末分化細(xì)胞,自噬的發(fā)生顯得尤為重要。近年來,越來越多的研究集中到脊髓損傷后自噬的發(fā)生以及作用機(jī)制。 第一章急性脊髓損傷模型的建立 [摘要]目的制作脊髓損傷模型,為脊髓損傷后神經(jīng)再生和修復(fù)提供良好的觀察模型。方法采用SPF級Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),成年雄性,體重在200-250g之間,分為正常的脊髓,損傷后4h(小時)、1d(天)、3d、7d、21d、60d和90d幾個小組,每個小組8只動物,實驗動物給予10%戊巴比妥鈉300mg/kg的腹腔注射麻醉。制作右側(cè)半橫切的急性脊髓損傷模型。采用HE染色和甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行脊髓損傷后病理學(xué)檢測,利用BBB評分法評價損傷后動物的運動功能。結(jié)果在急性脊髓損傷動物模型制作過程和制作后會出現(xiàn)部分動物死亡的現(xiàn)象,死亡的動物及時給與補(bǔ)充。HE病理學(xué)檢測顯示正常脊髓切片,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均勻分布,細(xì)胞胞體飽滿,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)界限明顯。脊髓損傷的組織切片內(nèi)出現(xiàn)大量的空腔,空腔內(nèi)存在壞死組織碎片,細(xì)胞組織內(nèi)出現(xiàn)液化壞死。白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)組織廣泛水腫的現(xiàn)象,呈海綿狀。脊髓損傷3d后,大鼠右后側(cè)肢體癱瘓,無運動,BBB評分平均值為0.7分；隨著損傷時間的延長,大鼠脊髓的運動有部分功能的恢復(fù),在損傷后60d和90d,大鼠后肢的三個關(guān)節(jié)存在輕微的活動,有些甚至出現(xiàn)兩到三個關(guān)節(jié)的廣泛運動,經(jīng)BBB評分平均值為6.8分。結(jié)論右側(cè)半橫切的急性脊髓損傷模型不但能造成模型動物的感覺和運動的半邊癱瘓,同時為脊髓損傷后神經(jīng)再生和修復(fù)提供了良好的觀察模型。 [摘要]目的探討脊髓損傷后自噬的發(fā)生和自噬流的動態(tài)過程,并確定自噬在脊髓損傷后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的定位。方法制作半橫切的急性脊髓損傷模型,損傷后4h、1d、3d、7d、21d,利用Western和免疫組織化學(xué)檢測方法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclinl、LC3的表達(dá),利用RT-PCR檢測Beclinl mRNA的表達(dá),透射電鏡檢查損傷后自噬小體的形成。利用West(;rn檢測方法檢測自噬底物蛋白p62的表達(dá),并利用免疫組織化學(xué)檢測方法檢測自噬和神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的共定位。結(jié)果經(jīng)過Western條帶的密度掃描分析和免疫組織化學(xué)檢測,脊髓損傷后4h LC3和Beclinl蛋白的表達(dá)量較正常對照的脊髓組織有所提高,隨著時間的延長,兩者的表達(dá)量也隨著升高,在脊髓損傷的3d達(dá)到表達(dá)量的高峰期,在7d和21d表達(dá)量逐漸降低,但較正常對照組仍有所升高。經(jīng)過透射電鏡觀察,我們發(fā)現(xiàn)正常對照的脊髓組織結(jié)構(gòu)顯示正常,髓鞘呈同心圓排列,層間排列結(jié)合緊密。脊髓損傷后4h,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)出現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象,層間的排列發(fā)生紊亂,出現(xiàn)大量空泡。經(jīng)Western檢測顯示,脊髓損傷4h后自噬底物p62的表達(dá)量較正常對照組織有所下降,并隨著損傷進(jìn)程的進(jìn)行,表達(dá)量逐漸降低,1d、3d、7d和21d均較正常對照組織有大量的降低,較正常對照的脊髓組織表達(dá)量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。經(jīng)過共定位發(fā)現(xiàn),脊髓損傷后自噬發(fā)生于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中。結(jié)論脊髓損傷后神經(jīng)組織發(fā)生了自噬,并且隨著損傷病理的進(jìn)程,自噬的活性不斷增強(qiáng),在3d達(dá)到了高峰期。自噬的過程不僅發(fā)生于脊髓組織的神經(jīng)元,同時也發(fā)生于膠質(zhì)細(xì)胞中,提示自噬的活動對脊髓損傷的病理活動存在一定的影響。 第三章脊髓損傷后自噬發(fā)生的作用 [摘要]目的探討急性脊髓損傷后,自噬活動的發(fā)生對脊髓功能恢復(fù)的作用。方法采用自噬抑制劑3-MA和自噬增強(qiáng)劑Rapamycin腹腔注射脊髓損傷后的大鼠,于損傷后4h,1d、3d、7d、21d通過Western和免疫組織化學(xué)檢測方法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclinl、LC3的表達(dá),并利用BBB評分法檢測自噬抑制和增強(qiáng)后對脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)作用。結(jié)果經(jīng)過Western和免疫組織化學(xué)檢測,我們發(fā)現(xiàn)單純的脊髓損傷組各個時間點的Beclinl和LC3B的表達(dá)較正常對照組均有所提高。3-MA組中,B eclinl和LC3B的表達(dá)在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,Rapamycin組中,Beclinl和LC3B的表達(dá)在脊髓損傷4h, Id、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。經(jīng)過免疫組織化學(xué)的LC3和1AP-2、 GFAP的共定位,3-MA組中,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的自噬的表達(dá)在4h、1d、3d、7d和21d逐漸降低,較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。Rapamycin組中,神經(jīng)元中和膠質(zhì)細(xì)胞的自噬的表達(dá)在4h、1d、3d、7d和21d逐漸升高,較單純的脊髓損傷組有所提高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。經(jīng)BBB評分,抑制自噬能阻礙脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復(fù),增強(qiáng)自噬能促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復(fù)。結(jié)論脊髓損傷后,3-MA能夠抑制自噬的發(fā)生,Rapamycin能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生。3-MA能夠抑制噬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生,Rapamycin能夠促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞自噬的發(fā)生。抑制自噬能阻礙脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復(fù),增強(qiáng)自噬能促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運動功能的恢復(fù)。 第四章脊髓損傷自噬對神經(jīng)功能修復(fù)的作用機(jī)制 [摘要]目的探討急性脊髓損傷后,自噬過程對脊髓神經(jīng)功能修復(fù)的作用機(jī)制。方法采用自噬抑制劑3-MA和自噬增強(qiáng)劑Rapamycin腹腔注射脊髓損傷后的大鼠,于損傷后4h、1d、3d、7d、21d通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測凋亡指示蛋白activated caspase-3表達(dá),通過Western檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BAX的表達(dá),并利用BBB評分法檢測自噬抑制和增強(qiáng)后對脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)作用。結(jié)果經(jīng)凋亡表達(dá)的marker蛋白activated caspase-3與脊髓組織神經(jīng)元的marker蛋白MAP2及膠質(zhì)細(xì)胞的marker蛋白GFAP的免疫組織化學(xué)共定位發(fā)現(xiàn),3-MA組中,activated caspase-3在損傷脊髓組織中的表達(dá)量在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所上升,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。 Rapamycin組中,activated caspase-3的表達(dá)在脊髓損傷4h、1d、3d,7d和21d后在損傷脊髓組織中的表達(dá)量較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。經(jīng)過Western檢測,我們發(fā)現(xiàn)單純的脊髓損傷組各個時間點的Bcl-2的表達(dá)較正常對照組均有所提高。3-MA組中,Bcl-2的表達(dá)在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義, P0.05。Rapamycin組中,Bcl-2的表達(dá)在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。經(jīng)過Western檢測,我們發(fā)現(xiàn)單純的脊髓損傷組各個時間點的BAX的表達(dá)較正常對照組均有所下降。3-MA組中,BAX的表達(dá)在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所上升,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。Rapamycin組中,BAX的表達(dá)在脊髓損傷4h、1d、3d、7d和21d后較單純的脊髓損傷組有所下降,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。結(jié)論脊髓損傷后,自噬的抑制能夠誘發(fā)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡,自噬的增強(qiáng)能夠抑制神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡；自噬的抑制能夠抑制Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)BAX的表達(dá),自噬的增強(qiáng)能夠促進(jìn)Bcl-2的表達(dá),抑制BAX的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.2

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本文編號：2352751