【摘要】：背景：每年都有數(shù)百萬(wàn)的病人在實(shí)施全身麻醉的情況下,完成外科手術(shù)以及伴有疼痛刺激的醫(yī)學(xué)檢查操作。但是,近年來(lái)人們不斷地在新生動(dòng)物模型中觀察到：全身麻醉能誘導(dǎo)出廣泛的腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,同時(shí)伴隨腦功能的長(zhǎng)期性損害。且人類流行病學(xué)研究的結(jié)果也表明：曾在3歲以內(nèi)接受過(guò)麻醉處理的小兒,在10歲時(shí)與同齡未接受過(guò)麻醉的兒童相比,存在發(fā)生語(yǔ)言、抽象推理缺陷以及學(xué)習(xí)障礙的高風(fēng)險(xiǎn)。目前越來(lái)越多的關(guān)注集中到全麻藥物腦神經(jīng)毒性的研究上,尤其是對(duì)于那些腦發(fā)育處于高峰期而又需要接受外科手術(shù)治療的早產(chǎn)兒、新生兒、嬰幼兒和胎兒,全身麻醉藥物在這些患兒中的安全應(yīng)用問(wèn)題引起了廣大兒科臨床醫(yī)師、政府衛(wèi)生部門的密切關(guān)注和擔(dān)憂。并且已有的研究結(jié)果又提出了很多亟待解決的問(wèn)題,如：為什么一些腦部區(qū)域相對(duì)于其它的腦區(qū),神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的程度更嚴(yán)重?為什么一些神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生了凋亡,而與其毗鄰的神經(jīng)元細(xì)胞看上去(形態(tài)學(xué)方法觀察)似乎沒(méi)有受到任何影響?為什么成年動(dòng)物的大腦相較于新生動(dòng)物的大腦,表現(xiàn)出對(duì)麻醉藥腦毒性作用的不敏感?雖然全麻藥物的腦神經(jīng)毒性作用機(jī)制并不清楚,但是了解全身麻醉后腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的區(qū)域分布模式,即全麻藥物腦神經(jīng)毒性的易感區(qū)域選擇性,這一點(diǎn)對(duì)于回答前面所提出的問(wèn)題、解釋現(xiàn)象背后的發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要。方法：第一部分 全身麻醉藥物的腦神經(jīng)毒性具有依賴于年齡的區(qū)域選澤性新生期(P7)、青春期(P21)、成年期(P49)小鼠被隨機(jī)分入相應(yīng)年齡組的麻醉組和無(wú)麻醉組。其中麻醉組(Anaesthesia)禁食、持續(xù)吸入1.5% Isoflurane(異氟烷)和[30% Oxygen (氧氣)+70% Nitrogen(氮?dú)?]的混合氣體6小時(shí)。而與此同時(shí),無(wú)麻醉組(No Anaesthesia)、鼠吸入空氣并同時(shí)禁食6小時(shí)。所有麻醉組和無(wú)麻醉組的小鼠均予以腹膜內(nèi)注射ketamine(20mg/kg)+acepromazine (0.5mg/kg)+xylazine (1 mg/kg)處死。即刻經(jīng)左心室灌注含5% glycerol和5% su crose的冰冷PBS緩沖液；待自右心耳流出的血液轉(zhuǎn)變?yōu)槌吻宓墓嘞匆汉?再用含5%glycerol和5% sucrose的冰冷4%PFA(低聚甲醛)經(jīng)心臟灌注。取出小鼠腦組織,用4%PFA固定,并制作腦組織冰凍切片。運(yùn)用細(xì)胞凋亡標(biāo)記物-Cleaved Caspase-3(AC3),對(duì)(1)DG—齒狀回的顆粒細(xì)胞下層-顆粒細(xì)胞層、(2)CAl—海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層、(3)RSA--大腦皮層RSA區(qū)的第2/3層、(4)CPu—紋狀體的caudoputamen區(qū)、(5)GrO—嗅球的顆粒細(xì)胞層、(6)Cb—小腦皮層、(7)Cbwm-小腦白質(zhì),共7個(gè)腦內(nèi)區(qū)域行凋亡神經(jīng)元細(xì)胞的定量分析；并在同一年齡組內(nèi),同一腦部區(qū)域,比較麻醉組與無(wú)麻醉組之間凋亡神經(jīng)元細(xì)胞密度(AC3+/mm3)是否存在差異以及差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二部分 全身麻醉藥物的腦神經(jīng)毒性具有依賴于神經(jīng)元細(xì)胞年齡的選擇性在不同年齡點(diǎn)接受腹膜內(nèi)注射BrdU來(lái)標(biāo)記腦內(nèi)海馬齒狀回新生顆粒神經(jīng)元細(xì)胞的小鼠以及未接受BrdU注射的小鼠(應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法標(biāo)記不同成熟階段的海馬齒狀回顆粒神經(jīng)元細(xì)胞)、在出生后21天(P21)時(shí),給予禁食、持續(xù)吸入1.5%Isoflurane(異氟烷)和[30% Oxygen (氧氣)+70% Nitrogen (氮?dú)?]的混合氣體6小時(shí)。然后予以腹膜內(nèi)注射ketamine (20 mg/kg)+acepromazine (0.5mg/kg)+xylazine(1 mg/kg)處死。即刻經(jīng)左心室灌注含5%glycerol和5%sucrose的冰冷PBS緩沖液；待自右心耳流出的血液轉(zhuǎn)變?yōu)槌吻宓墓嘞匆汉?再用含5%glycerol和5%sucrose的冰冷4%PFA(低聚甲醛)經(jīng)心臟灌注。取出小鼠腦組織,用4%PFA固定,制作腦組織冰凍切片和行免疫熒光組織化學(xué)染色。所應(yīng)用的代表海馬齒狀回顆粒神經(jīng)元細(xì)胞不同成熟階段的標(biāo)記物包括：①標(biāo)記早期神經(jīng)祖細(xì)胞(early progenitors)的Sox2；②標(biāo)記晚期神經(jīng)祖細(xì)胞(late progenitors)的NeuroD1;③標(biāo)記不成熟顆粒神經(jīng)元細(xì)胞(immature granule cells) 的 calretinin;④標(biāo)記成熟顆粒神經(jīng)元細(xì)胞(mature granule cells)的calbindin。再與細(xì)胞凋亡標(biāo)記物-Cleaved Caspase3 (AC3,效應(yīng)子Caspase 3)相結(jié)合,行以下定量分析：①計(jì)算出所有BrdU+細(xì)胞中BrdU+/AC3+共免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例,即(BrdU+-AC3+) /BrdU+比值。②計(jì)算出各總AC3+細(xì)胞中每一種成熟標(biāo)記物免疫染色陽(yáng)性的細(xì)胞所占的比例,即(Sox2+-AC3+)/AC3+比值,(NeuroD1+-AC3+)/AC3+比值,(calretinin+-AC3+)/AC3+比值,(calbindin+-AC3+)/AC3+比值。以上來(lái)證實(shí)腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)于全麻誘導(dǎo)凋亡這一毒性作用存在著一個(gè)特殊的神經(jīng)元細(xì)胞年齡的易感窗。結(jié)果：第一部分 全身麻醉藥物的腦神經(jīng)毒性具有依賴于年齡的區(qū)域選擇性與無(wú)麻醉組相比,麻醉組中的P7小鼠在以下腦部區(qū)域的凋亡神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量發(fā)生了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高：RSA區(qū)(11倍),CPu區(qū)(10倍),CA1區(qū)(3倍),Cb區(qū)(4倍)及GrO區(qū)(4倍)。更重要的發(fā)現(xiàn)是：標(biāo)志神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的AC3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),在P21小鼠及P49小鼠的DG和GrO區(qū)仍保持具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高,分別為P21小鼠(15倍和12倍),P49小鼠(2倍和4倍)。第二部分 全身麻醉藥物的腦神經(jīng)毒性具有依賴于神經(jīng)元細(xì)胞年齡的選擇性證實(shí)當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞的年齡在13天-15天時(shí)表現(xiàn)出對(duì)全麻藥物腦神經(jīng)毒性最高的敏感性,而隨后凋亡神經(jīng)元數(shù)量就大幅減少。同時(shí)運(yùn)用海馬齒狀回(DG)內(nèi)顆粒神經(jīng)元細(xì)胞處于不同成熟階段的標(biāo)記物：早期神經(jīng)祖細(xì)胞Sox2、晚期神經(jīng)祖細(xì)胞NeuroD1、不成熟顆粒神經(jīng)元細(xì)胞calretinin、成熟顆粒神經(jīng)元細(xì)胞calbindin行定量分析,證實(shí)晚期神經(jīng)祖細(xì)胞(NeuroD1)口不成熟顆粒神經(jīng)元細(xì)胞(calretinin),對(duì)持續(xù)6h吸入1.5% Isoflurane(異氟烷)誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的神經(jīng)毒性作用最敏感,而早期神經(jīng)祖細(xì)胞和成熟的顆粒神經(jīng)元細(xì)胞未受到明顯影響。結(jié)論：該研究在肯定了既往有關(guān)新生動(dòng)物前腦對(duì)全身麻醉藥物腦神經(jīng)毒性作用的高度易感性的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種易感性可以延續(xù)至成年動(dòng)物,但是僅局限于能持續(xù)神經(jīng)發(fā)生的DG(海馬齒狀回)和GrO(嗅球顆粒細(xì)胞層)區(qū)。全身麻醉藥物引發(fā)的腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是具有一定選擇性的。首先,全身麻醉藥物引發(fā)的腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是具有依賴于麻醉時(shí)動(dòng)物年齡的區(qū)域選擇性的。麻醉誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞廣泛性凋亡的易感時(shí)間窗,是在腦內(nèi)不同區(qū)域各自的神經(jīng)發(fā)生高峰時(shí)間窗后的1周～2周。其次,全麻藥物腦神經(jīng)毒性選擇性不僅僅是簡(jiǎn)單地由動(dòng)物的年齡決定,而且是更精確的是取決于麻醉時(shí),神經(jīng)元細(xì)胞的年齡以及其成熟狀態(tài)。在海馬齒狀回,不成熟的顆粒神經(jīng)元細(xì)胞且年齡在13天-15天時(shí)表現(xiàn)出對(duì)全麻藥物腦神經(jīng)毒性作用最高的易感性。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R726.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊炯炯,沈政;載人航天中微重力環(huán)境對(duì)認(rèn)知功能的影響[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2003年06期

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本文編號(hào)：2313064