【摘要】：研究背景 Sewell在1955年結(jié)扎狗冠狀動(dòng)脈時(shí),發(fā)現(xiàn)恢復(fù)血流后組織器官損傷加重。缺血再灌注損傷被首次發(fā)現(xiàn),在之后的大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)。肢體缺血再灌注損傷(Limb ischemia reperfusion injury-LIRI)不僅可導(dǎo)致局部組織損傷,還可引起遠(yuǎn)隔臟器損傷,小腸缺血再灌注損傷還會(huì)因?yàn)榧?xì)菌和毒素的釋放,誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),多器官功能障礙綜合征(MODS)等。目前對(duì)小腸缺血再灌注損傷的研究大都與凋亡有關(guān)。以往認(rèn)為壞死和凋亡是缺血再灌注所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的主要方式。近年來(lái),一種新的程序性細(xì)胞死亡方式——自噬(Autophagy),即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,越來(lái)越受到重視。適度的自噬是細(xì)胞完成自身代謝和細(xì)胞器更新的重要方式,對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,以及調(diào)控細(xì)胞損傷和老化具有重要意義；而非生理性的、過(guò)度的自噬則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)多死亡,從而引起組織器官產(chǎn)生病理性變化。自噬甚至可能影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生,自噬在小腸缺血再灌注損傷的不同階段扮演著不同角色,缺血期自噬輕度增加,具有一定的保護(hù)作用；但是在再灌注期自噬明顯增加,反而加重小腸損傷。種種跡象表明,再灌注后小腸細(xì)胞自噬異常增多可能是導(dǎo)致小腸結(jié)構(gòu)和功能損傷的重要啟動(dòng)因素之一。如果能夠早期、有效抑制自噬的發(fā)生,有望減輕小腸缺血再灌注損傷,甚至減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 鹽酸戊乙奎醚注射液(長(zhǎng)托寧)是我國(guó)自主研制的新型抗膽堿藥,具有選擇性M1、M3和N1、N2受體拮抗作用,對(duì)中樞和外周均有很強(qiáng)的抗膽堿作用,而對(duì)M2受體無(wú)明顯作用,可有效避免阿托品因缺乏M受體亞型選擇性所致的心動(dòng)過(guò)速與阻斷突觸前膜M2受體調(diào)節(jié)功能,且藥效長(zhǎng)而副作用較少。前期的研究表明,長(zhǎng)托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘發(fā)的小腸細(xì)胞凋亡,但長(zhǎng)托寧對(duì)小腸細(xì)胞自噬的影響研究文獻(xiàn)報(bào)道較少。 研究目的 本實(shí)驗(yàn)以肢體缺血再灌注損傷大鼠小腸為實(shí)驗(yàn)研究和觀察對(duì)象,建立肢體缺血再灌注模型,以長(zhǎng)托寧進(jìn)行干預(yù),觀察各組LDH釋放量。從而評(píng)價(jià)各組小腸組織和細(xì)胞的受損程度；熒光染色、并通過(guò)RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)小腸組織的自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene, Atg)的mRNA和蛋白表達(dá)水平,從細(xì)胞和分子水平探討長(zhǎng)托寧對(duì)肢體缺血再灌注損傷中小腸細(xì)胞自噬的影響,為臨床圍手術(shù)期小腸保護(hù)提供新的理論基礎(chǔ)和可能的治療方法。 研究方法和結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)主要分為二個(gè)部分,主要方法和結(jié)果如下： 一.大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)小腸自噬的研究 1、實(shí)驗(yàn)分組： 成年雄性SD大鼠48只,隨機(jī)分為2組,假手術(shù)組(S組),缺血再灌注組(LIR組),S組、LIR組組內(nèi)按再灌注時(shí)間分為再灌注0h(To)、2h(T2)、4h(T4),、8h(T8)4個(gè)亞組,每亞組6只。 假手術(shù)組(S組)：成年SD大鼠,暴露股動(dòng)脈后僅于股動(dòng)脈表面穿過(guò)縫線,并不結(jié)扎股動(dòng)脈,于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)取血及小腸組織,隨即處死大鼠。 缺血再灌注組(LIR組)：成年SD大鼠,分離暴露股動(dòng)脈,動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3,,再灌注0h、2h、4h、8h。于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)取血及小腸組織,并處死大鼠。 2、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的建立方法該實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均嚴(yán)格遵循有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)規(guī)定,術(shù)前禁食不禁水,大鼠稱(chēng)重后吸入2%-3%七氟醚淺麻醉下,將大鼠固定于試驗(yàn)臺(tái),采用文獻(xiàn)方法建立大鼠肢體缺血再灌注模型。具體方法：常規(guī)消毒后,切開(kāi)皮膚、皮下,暴露股血管神經(jīng)束,分離股動(dòng)脈,動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3h,再灌注0h、2h、4h、8h。S組暴露股動(dòng)脈后在其下方放一絲線,不阻斷血流,LIR組阻斷血流。 3、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的鑒定 實(shí)驗(yàn)分為2組,即S組和LIR組。乳酸脫氫酶漏出量可以間接反映小腸組織損傷情況,通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDH釋放量等方法驗(yàn)LIR的小腸損傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIR組大鼠T2及以后各時(shí)點(diǎn)血清LDH明顯高于對(duì)照組(P0.01)。說(shuō)明本方法建立的肢體缺血再灌注損傷模型成功。 表明缺血再灌注損傷造成小腸細(xì)胞損傷,并可影響小腸功能。 4.大鼠肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)小腸細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的研究 (1)大鼠肢體缺血再灌注損傷對(duì)小腸細(xì)胞Beclinl的mRNA表達(dá)的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測(cè)各組小腸細(xì)胞Beclinl的nRNA表達(dá)量。結(jié)果：LIR組小腸組織T2及以后各時(shí)點(diǎn)的Beclinl的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于S組(P0.01)。 說(shuō)明缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細(xì)胞自噬,造成小腸細(xì)胞損傷。 (2)大鼠肢體缺血再灌注損傷對(duì)小腸細(xì)胞Atg5的mRNA表達(dá)的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測(cè)各組小腸細(xì)胞Atg5的mRNA表達(dá)量。結(jié)果：LIR組小腸組織T2及以后各時(shí)點(diǎn)的Atg5的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于S組(P0.01)。 說(shuō)明缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細(xì)胞自噬,造成小腸細(xì)胞損傷。 (3)大鼠肢體缺血再灌注損傷對(duì)小腸細(xì)胞LC3的蛋白表達(dá)的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用Western-blot方法定量檢測(cè)各組小腸細(xì)胞LC3的蛋白表達(dá)量。結(jié)果：LIR組小腸組織T2及以后各時(shí)點(diǎn)的LC3II/LC3I的相對(duì)表達(dá)量明顯高于S組(P0.01)。 說(shuō)明缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細(xì)胞自噬,造成小腸細(xì)胞損傷。 二.長(zhǎng)托寧通過(guò)抑制細(xì)胞自噬減輕小腸缺血再灌注損傷 1、實(shí)驗(yàn)分組：成年雄性SD大鼠48只,隨機(jī)分為2組。缺血再灌注組(LIR組),長(zhǎng)托寧處理組(PHC組)。LIR組、PHC組組內(nèi)按再灌注時(shí)間分為再灌注Oh (To)、2h(T2)、4h(T4)、8h (T8)4個(gè)亞組,每亞組大鼠6只。 缺血再灌注組(LIR組)：成年SD大鼠,分離暴露股動(dòng)脈,動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3h,再灌注Oh、2h、4h、8h。分別于再灌注開(kāi)放前10min由尾靜脈給予相同劑量的生理鹽水,于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)處死大鼠,取血及小腸組織。 長(zhǎng)托寧處理組(PHC組)：成年SD大鼠,分離暴露股動(dòng)脈,動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈；再用市售橡皮筋(直徑2.5cm)環(huán)扎大鼠雙下肢近心端(壓力290-310mmHg,1mm Hg=0.133kpa)3h,再灌注0h,2h,4h,8h。分別于再灌注開(kāi)放前15min由尾靜脈給予0.15mg.kg-1的長(zhǎng)托寧,于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)處死大鼠,取血及小腸組織。 2、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的建立方法：同第一部分。 3、大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的鑒定 實(shí)驗(yàn)分為2組,LIR組和PHC組。通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDH釋放量等方法驗(yàn)證肢體缺血再灌注的小腸損傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHC組大鼠T2及以后各時(shí)點(diǎn)血清LDH明顯低于LIR組(P0.01)。說(shuō)明本方法建立的肢體缺血再灌注損傷模型成功。也說(shuō)明長(zhǎng)托寧可減輕由缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的小腸損傷。 4.長(zhǎng)托寧對(duì)小腸細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的研究 (1)長(zhǎng)托寧對(duì)小腸細(xì)胞Beclinl的mRNA表達(dá)的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測(cè)各組小腸細(xì)胞Beclinl的mRNA表達(dá)量。結(jié)果：PHC組小腸組織T2以后時(shí)點(diǎn)的Beclinl的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于LIR組(P0.01)。 說(shuō)明長(zhǎng)托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的小腸細(xì)胞自噬,減輕小腸組織損傷。 (2)長(zhǎng)托寧對(duì)小腸細(xì)胞Atg5的mRNA表達(dá)的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用RT-PCR方法定量檢測(cè)各組小腸細(xì)胞Atg5的mRNA表達(dá)量。結(jié)果：PHC組小腸組織T2及以后時(shí)點(diǎn)的Atg5的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于LIR組(P.01)。 說(shuō)明長(zhǎng)托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的小腸細(xì)胞自噬,減輕小腸組織損傷。 (3)長(zhǎng)托寧對(duì)小腸細(xì)胞LC3的蛋白表達(dá)的影響 收集各組處理后的小腸組織。采用Western-blot方法定量檢測(cè)各組小腸細(xì)胞LC3的蛋白表達(dá)量。結(jié)果：PHC組小腸組織T2以后時(shí)點(diǎn)的LC3II/LC3I蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于LIR組(P0.01) 說(shuō)明長(zhǎng)托寧可抑制由缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的小腸細(xì)胞自噬,減輕小腸組織損傷。 主要結(jié)論 研究應(yīng)用成年SD大鼠,成功建立肢體缺血再灌注損傷的模型,以長(zhǎng)托寧進(jìn)行干預(yù),觀察長(zhǎng)托寧對(duì)缺血再灌注小腸細(xì)胞自噬及自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響,以闡明長(zhǎng)托寧通過(guò)抑制自噬減輕小腸細(xì)胞缺血再灌注損傷及其機(jī)制。 主要結(jié)論如下： 1.本研究應(yīng)用肢體缺血再灌注損傷的模型在導(dǎo)致小腸組織損傷方面可達(dá)到滿意效果。 2.肢體缺血再灌注損傷可誘發(fā)小腸細(xì)胞自噬。 3.長(zhǎng)托寧可抑制由肢體缺血再灌注損傷誘發(fā)的小腸細(xì)胞自噬。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R614

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2304534