【摘要】：第一部分胃腸外科手術后腹腔引流液的分析檢測目的：探討胃腸外科患者手術后腹腔引流液中炎癥因子成分的濃度變化規(guī)律方法：利用外科手術術后腹腔內(nèi)常規(guī)留置腹腔引流管的治療特點,不額外增加創(chuàng)傷的收集手術后患者的腹腔引流液。取患者在手術剛開始時,取患者剛開腹時的腹腔內(nèi)腹水；并收取患者在手術后1-7天的,每日清晨時分時間點,患者腹部的腹腔引流管引流出的新鮮的腹腔引流液。在4℃10000 rpm、min離心處理后,收取上清液并存在-80℃冰箱。在完成足夠例數(shù)的引流液收集后,使用ELISA法檢測患者腹腔引流液中炎癥因子IFN-γ、IL一17以及TGF-β的濃度改變情況。給每例患者均繪制手術后腹腔內(nèi)IFN-γ、IL—17以及TGF-β的濃度變化曲線圖。使用方差分析的統(tǒng)計學分析方法比較不同時間點上述檢測指標變化的差異性。結果：從2012年10月至2014年4月,共收集了武漢協(xié)和醫(yī)院胃腸外科接受了開腹手術的結腸癌根治術患者60例(已排除所有在術后出現(xiàn)了腸漏／疑似感染等特殊情況的患者)�？梢娫谑中g前,患者的腹腔液體中,IL-17與IFN-γ均處于極低水平。臨床手術后患者的腹腔引流液中IL-17含量在手術后12h即已經(jīng)開始上升,術后24h即達到峰值(68.18±12.36 pg/ml).隨后迅速下降,在手術后第二天,IL-17已經(jīng)下降到峰值的一半以下(33.16±7.24 pg/ml)；手術后第4d,IL-17已經(jīng)基本降低到基線水平。與IL-17變化趨勢類似,臨床手術患者的腹腔引流液中,IFN-γ含量在手術后12h也開始迅速上升,術后第2d達到峰值(75.77±11.21pg/ml);IFN-γ維持在較高濃度到第4d開始下降,術后第六天達到基線水平。與此不同的是,患者TGF-β在手術后12h即達到峰值82.42±10.12 pg/ml。隨后其濃度逐漸下降到第3d的37.50±7.22pg/m1.從第4天開始到患者拔出引流管的第7天,腹腔TGF-β濃度再次開始上升,其中第6d再次達到第二個峰值(95.12±16.19pg,/m1)結論：(1)腹部手術后,患者腹腔引流液中,炎癥因子IL-17和IFN-γ含量在手術后1-2d迅速升高并達到峰值,隨后其濃度迅速下降(在沒有術后并發(fā)感染的前提下),在手術后5-7d,重新回歸到類似于術前的基線水平。(2)腹部手術后,患者腹腔引流液中,纖維化相關因子TGF-β在手術后呈現(xiàn)兩個峰值。第一個峰值出現(xiàn)在手術后12-24h,隨后TGF-β濃度會下降,但隨后會在第4d左右再次上升,在術后6-7d重新達到新的峰值。第-2部分小鼠腹腔粘連模型的構建與評估目的：探討如何在實驗動物模型中穩(wěn)定模擬外科手術術后腹腔粘連形成的過程方法：參考目前已有的文獻報道,采用開腹手術的方式構建小鼠腹腔粘連模型。具體執(zhí)行過程為：使用滅菌的3%水合氯醛,按照小鼠體重給藥,給藥劑量為8κl/g：給藥方式采取腹腔注射。腹腔注射后大約5分鐘左右,小鼠即進入麻醉狀態(tài)。以小鼠四肢無主動運動,止血鉗試探性夾腳無反應為麻醉滿意指標,即可開始實驗。為確保小鼠手術創(chuàng)傷類同,取腹部正中線切口2cm,依次切開皮膚,腹肌進入腹腔。使用無菌紗布纏繞止血鉗并使用生理鹽水打濕。采取以下不同策略模擬手術創(chuàng)傷：A：腹壁摩擦20次B：盲腸及其上下段每隔2cm一處一個點共5個點,每個點摩擦20次C：A+BD：A+B但摩擦次數(shù)均減半A,B,C,D四組老鼠每組10只。完成手術后第7天,處死小鼠并打開小鼠腹腔,觀察粘連形成情況,粘連形成評估采取以下評分體系進行：0：無粘連1：1處輕微的易剝離粘連2：1處輕微的易剝離粘連3：存在1處較重的不易分離的粘連4：存在1處的較重的不易分離的粘連5：存在多處較重的不易分離的粘連且粘連中有血管組織形成分別評估A,B,C,D四組手術方法下,四組老鼠的粘連形成情況及死亡率情況,選取死亡率偏低而粘連形成比率最高的一組最為腹腔粘連模型構建組。結果：手術后7d處死小鼠后進行腹腔粘連評分及死亡率比較,結果如下：A組：粘連得分1.8±0.3死亡率0%B組：粘連得分4.0±0.2死亡率20%C組：粘連得分4.3±0.5死亡率20%D組：粘連得分4.2±0.4死亡率0%結論：單獨摩擦損傷腹膜并不能有效的誘導腹腔粘連形成,過度的摩擦腸壁將會導致腸道穿孔進而致使小鼠死亡。只有同時摩擦腹壁及腸道,并控制摩擦次數(shù),才能在保證低死亡率的背景下有效的控制小鼠腹腔粘連的穩(wěn)定及成型。因此應該選擇盲腸及其上下段每隔2cm一處一個點共5個點,每個點摩擦10次+腹壁摩擦10次的方法進行小鼠腹腔粘連模型的造模。第三部分 小鼠腹腔粘連模型中IL-17,IFN-γ及TGF-β的表達規(guī)律及來源分析目的：研究在腹腔粘連模型下,小鼠腹部炎癥因子IL-17及IFN-γ在術后不同時間點的變化規(guī)律,并分析這些炎癥因子的來源及效果。同時評估纖維化形成相關關鍵因子TGF-β在腹腔中的濃度變化趨勢規(guī)律。方法：選取手術前,標準手術后2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h,分別處死小鼠,腹腔注射無菌PBS2ml,腹腔輕柔按摩5min后,回抽腹腔灌洗液,并予以離心,洗滌,分離,細胞計數(shù)觀察炎癥細胞的浸潤程度變化(細胞計數(shù))、再給予染色CD4、IL-17 and IFN-γ,使用FACS(流式細胞術)檢測并評估各型細胞的數(shù)量變化反復重復實驗后,進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并得出變化趨勢圖。同時,對每一步離心后的上清液,快速存儲于-80℃冰箱,待各個時間點各種樣本收齊后,使用ELISA法,測定腹腔灌洗液中上述因子的濃度改變情況。結果：小鼠手術前基線狀態(tài)下,腹腔內(nèi)IL-17,IFN-γ含量接近于0(基線水平)。在手術后4h,小鼠的腹腔內(nèi)IL-17即迅速升高到峰值(123.56±19.28 pg/ml,隨后開始緩慢下降,在手術后第48h下降到46.72±7.17pg/ml,之后逐漸回歸基線水平。小鼠術后12h,IFN-γ上升到峰值70.95±19.29pg/mI隨后迅速下降到72h即處于基線水平。小鼠腹腔TGF-β在手術后4h即達到第一個峰值66.79±10.18pg/ml.隨后逐漸下降到時候24h達到低值19.18±5.28 pg/ml。隨后濃度會再次上升到時候第72h再次達到高峰103.25±20.14pg/ml.在術后炎癥反應的峰值4-12h,小鼠腹腔中分泌IFN-γ的細胞主要為Thl細胞,分泌IL-17的細胞為γδT,Thl7細胞。結論：與臨床標本數(shù)據(jù)十分類似,在小鼠腹腔粘連的模型中,也存在在術后早期的IL-17,IFN-γ急性峰值。同時也可觀察到時候1-7d的時間內(nèi),存在TGF-β的雙峰現(xiàn)象。而在小鼠模型中的手術后急性炎癥期,γ8T, Th1細胞急性分泌IL-17和IFN-γ,構成了術后早期炎癥反應的峰值。第四部分小鼠腹腔粘連模型的干預及療效分析目的：探討抗炎治療及抗纖維化治療的治療時間點及療效評估。方法：依據(jù)第三部分中測定的小鼠腹腔炎癥因子及TGF-P變化規(guī)律特點采取不同干預治療對策如下：(1)抗炎治療評估：分別使用不同濃度梯度的anti-IL-17; anti-IFN-y;在手術后0-2天,每天注射一次(d0,dl,d2),觀察治療效果。再使用濃度梯度實驗中的最佳梯度濃度,分別選取術后1-3天(d1,d2,d3),術后4-6天(d4,d5,d6)兩組不同時間點,分別每天注射一次,觀察抗粘連起效的最佳時間點。(2)抗纖維化評估：參照抗炎治療策略,使用anti-TGF-β;觀察手術后使用不同濃度梯度及時間梯度下,anti-TGF-β對于防治腹腔粘連的效應評價。結果：100μg的抗體用量為炎癥因子IL-17, IFN-y阻斷的最佳劑量。早期阻斷IL-17(術后d0-d2)的抗粘連效果顯著高于晚期阻斷(術后d4-d6)(1.7±0.6 vs 4.14±0.9,p=0.001)。與此類似早期阻斷IFN-γ(術后d0-d2)的抗粘連效果顯著高于晚期阻斷(術后d4-d6)(1.5+0.4 vs 4.0±0.8,p=0.001)。但是對于TGF-β,晚期阻斷(術后d4-d6)的抗粘連效果顯著高于早期阻斷(術后d1-d3)(4.2±0.8 vs 1.3±0.6,p=0.003)結論：早期的抗炎癥處理和晚期的抗TGF-β處理可預防術后粘連的形成。與此相反,晚期的抗炎處理和早期的抗TGF-β處理對于腹腔粘連的形成沒有影響。第五部分炎癥因子與纖維化因子相互間影響機制分析目的：探討早期炎癥反應對于后期纖維化環(huán)境平衡的影響及其作用機制。方法：處死小鼠后,腹腔注射2m1胰酶-EDTA消化液；37℃下?lián)u床輕度搖15min。吸出消化液并加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中和。離心后收集并于6孔板中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的腹膜間皮細胞培養(yǎng)時間約為1周左右,在培養(yǎng)的第二周開始進行傳代培養(yǎng)。對傳代培養(yǎng)后指數(shù)生長期的活性良好的間皮細胞進行實驗。模擬第三、四部分獲得的腹腔粘連炎癥及纖維化環(huán)境,采取IL-17/IFN-y刺激24h+TGF-β刺激24h的治療策略,在完成共計48h的刺激策略后,收齊培養(yǎng)細胞的上清液測定其中t-PA/PAI-1濃度；并使用WB測定細胞中TGF-β的信號通路激活情況。評價上述炎癥因子對于間皮細胞的纖維化相關信號通路,如Smad2/3, Smad7的差別影響。同時,收取第四部分中,接受不同抗體處理組小鼠的粘連組織,勻漿處理后收集其中mRNA.測定其中與Thl,Th17,yδT相關的趨化因子如SDF-1, CCL-20/22/27, KC, MIP-1/2等的表達水平改變情況。結果：在細胞培養(yǎng)上清液檢測方面：PBS對照組中上清液中t-PA含量為101.32±15.12ng/ml;PAI含量為42.85±10.13ng/ml. IL-17預刺激組上清液中t-PA含量為51.12±6.02ng/ml;PAI含量為82.45±11.33ng/ml.IFN-y刺激組上清液中t-PA含量為91.12±11.32ng/ml;PAI含量為82.45±11.33ng/ml. IL-17+IFN-y刺激組上清液中t-PA含量為31.12±802ng/ml;PAI含量為162.45±25.93ng/ml.其中IL-17+IFN-y刺激處理后再使用TGF-β進行刺激,間皮細胞分泌的t-AP顯著減少,PAI-1顯著增加。在刺激后的細胞mRNA檢測方面：PBS對照組中間皮細胞t-PA/PAI-1 mRNA表達為1.0(作為對照組標準化).IL-17預刺激組中間皮細胞t-PA mRNA表達為0.42±0.13；PAI 2.46±0.78. IFN-y刺激組間皮細胞t-PA mRNA表達為1.02±0.43；PAI 0.99±0.18.IL-17+IFN-y刺激組間皮細胞t-PA mRNA表達為0.22±0.10；PAI 6.484±2.08.其中IL-17+IFN-y刺激處理后再使用TGF-β進行刺激,間皮細胞表達的t-AP顯著減少,PAI-1顯著增加。WB檢測也提示：與直接TGF-β刺激處理相比,IL-17+IFN-y提前預刺激處理下的間皮細胞具有更強的Smad 2/3激活比例。對手術后形成的粘連組織進行qPCR檢測炎癥趨化因子的mRNA結果為：CCL-22及KC表達顯著提高,其他趨化因子表達差異不明顯。結論：IL-17+IFN-y刺激下的間皮細胞,對TGF-β的反應性更強。其下游信號通路Smad2/3激活也更強。與此對應的,其上清液中,促纖維化因子PAI-1的含量也越高。手術后,腹膜間皮組織中,炎癥趨化因子表達顯著提高,間皮細胞趨化炎癥因子的能力也在術后顯著增強,其中SDF-1, CCL-22是手術前后顯著增加的趨化因子。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R656

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 伍湘臬;中藥治療腹腔粘連兩例[J];新醫(yī)學;1972年10期

2 路景莉,李蔚;腹腔粘連的研究進展[J];中國冶金工業(yè)醫(yī)學雜志;2001年04期

3 陳德軒,潘立群;腹腔粘連的研究現(xiàn)狀分析[J];浙江中西醫(yī)結合雜志;2001年09期

4 陳志新;腹腔粘連的形成及術后預防[J];中國普外基礎與臨床雜志;2003年05期

5 曾莉;腹腔粘連研究進展[J];南京中醫(yī)藥大學學報;2004年02期

6 劉洪斌,李東華,郭世鐸;腹腔粘連形成機制及治療研究進展[J];中國中西醫(yī)結合外科雜志;2005年01期

7 徐慶;曾莉;;腹腔粘連的治療進展[J];南京中醫(yī)藥大學學報;2007年05期

8 林剛;馬朋林;池春;徐浩明;樊雙義;冷凱利;來要水;;重組組織型纖溶酶原激活劑預防大鼠腹腔粘連的實驗研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2009年19期

9 春蓮;吳福林;;腹腔粘連的預防現(xiàn)狀[J];中國民族民間醫(yī)藥;2010年13期

10 李紹南;;中藥配合針術治療腹腔粘連的經(jīng)驗[J];中醫(yī)雜志;1959年12期

相關會議論文 前3條

1 王小晨;桂常青;鄭青山;;尿囊素、甲硝唑和地塞米松聯(lián)用對犬腹腔粘連模型的預防作用[A];中國藥理學會第八次全國代表大會暨全國藥理學術會議論文摘要匯編[C];2002年

2 魏長征;侯春林;王文斌;蔣麗霞;朱彬;;溫敏性幾丁糖預防術后腹腔粘連的實驗研究[A];2009年上海市醫(yī)用生物材料研討會論文匯編[C];2009年

3 謝建興;譚月紅;崔學教;趙江寧;;通腑瀉熱灌腸合劑對大鼠術后腹腔粘連及血TNF-α水平的影響[A];第七屆全國中西醫(yī)結合普通外科臨床及基礎研究學術會議論文匯編[C];2001年

相關重要報紙文章 前6條

1 北京大學腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤外科 陜飛 苗儒林 季加孚;預防腹腔粘連多靠屏障法[N];健康報;2013年

2 ;活血化瘀類中藥可防治婦科手術后腹腔粘連[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

3 蔡曉軍　靳曉方;人工氣腹法檢查腹腔粘連[N];健康報;2007年

4 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院普通外科副主任醫(yī)師 姚勝 整理 張獻懷 黃暉;經(jīng)常肚子疼 病根為腹腔粘連[N];健康報;2013年

5 無極縣東年村獸醫(yī)院 成慧奇;做好奶牛腹腔粘連的預防[N];河北科技報;2014年

6 程書權;大環(huán)內(nèi)酯類抗生素應用新探（下）[N];中國醫(yī)藥報;2000年

相關博士學位論文 前2條

1 宋志剛;不同分子量黃原膠的制備、分析及其預防大鼠術后腹腔粘連的研究[D];山東大學;2015年

2 汪賡;炎癥因子IL-17與纖維化因子TGF-β在腹腔手術術后腹腔粘連形成中的作用及相互影響研究[D];華中科技大學;2016年

相關碩士學位論文 前7條

1 高培源;術瑞吉對犬肝創(chuàng)傷止血及預防術后腹腔粘連的效果觀察[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2016年

2 張立儉;電針足三里干預大鼠腹腔粘連的作用及機制研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2010年

3 田易軍;卡巴膽堿干預大鼠腹腔粘連的作用及機制研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2009年

4 薛挺成;羧氨基葡聚多糖間斷腹腔內(nèi)注射預防大鼠術后腹腔粘連[D];南華大學;2013年

5 葛鵬;開腹與腔鏡手術后腹腔粘連程度的臨床對比研究[D];暨南大學;2007年

6 劉銘君;血府逐瘀制劑提取物對大鼠創(chuàng)傷刺激所致腹腔粘連防治作用的機理研究[D];天津醫(yī)科大學;2007年

7 林建波;S-100預防大鼠術后腹腔粘連作用的實驗研究[D];山東大學;2010年

，

本文編號：2252963