【摘要】：目的：中藥化學成分和體內(nèi)吸收代謝成分是中藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷進步,對中藥化學成分和體內(nèi)吸收代謝成分進行定性與定量分析已成分中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要手段之一。本論文以兩味常見中藥何首烏和附子為研究對象,采用超高壓液相與線性離子阱軌道離子阱組合高分辨質(zhì)譜(UHPLC-LTQ-Orbitrap)聯(lián)用技術(shù)系統(tǒng)分析附子和何首烏中的天然活性(毒性)成分。深入研究何首烏代表性成分二苯乙烯苷、蒽醌類等,附子代表性成分二萜類生物堿成分的高分辨多級質(zhì)譜裂解規(guī)律。在此基礎(chǔ)上開展何首烏藥材定量方法研究、大鼠體內(nèi)代謝輪廓研究和大鼠體內(nèi)藥代動力學研究,為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和中藥現(xiàn)代化研究探索新的可行的方法和技術(shù)。方法：1、運用LTQ-Orbitrap高分辨多級質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)研究何首烏主要成分二苯乙烯苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律。方法為以何首烏代表性成分二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等作為模式成分,采用直接持續(xù)進樣方式,進樣速度為8μ L/min。質(zhì)譜全掃描范圍為m/z 150-1500,高分辨全掃描分辨率設為30000(以m/z 400的半峰寬計),MS2-MS3采用Orbitrap高分辨掃描,掃描分辨率設為15000,MS4以后的子離子采用用LTQ打拿極(dynote)檢測。選擇上一級最高峰進行下級碎裂掃描,碎裂方式為碰撞誘導解離(CID)方式,其碰撞能量為35%。2、建立基于何首烏及相關(guān)藥材的化學成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,并運用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù),結(jié)合模式成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律,對何首烏藥材化學成分進行分析。液相條件為：色譜柱采用Thermo Hypersil Gold C18 column (2.1 × 100 mm,1.8 μm),流動相由乙腈(A)和含0.1%甲酸水(B)兩相組成,其洗脫梯度為：5% A(0min); 15%　A (6min),15%　A(12min); 38%　A(25min); 70%　A (30 min)和 90% A (35min)。流速為300μL/min。在線DAD檢測200-400 nm范圍光譜。質(zhì)譜條件為：通過電噴霧離子源(ESI)與液相部分連接,分別采用正、負離子檢測模式各采集一次,掃描范圍為m/z 150-1500,離子源所用氣體為氮氣。一級全掃描采用高分辨設置,其分辨率設置為30000,二級質(zhì)譜高分辨全掃描分辨率設為15000,三級質(zhì)譜高分辨全掃描設置為7500。多級掃描采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(data-dependent MSn scanning),選取上一級最高豐度母離子進行碎裂并進行動態(tài)排除設置(dynamics exclusion)。3、運用液相與離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立快速測定何首烏4種代表性成分大黃素、大黃素-8-O-葡萄糖苷、沒食子酸和二苯乙烯苷含量的方法,并對20批不同產(chǎn)地、不同炮制來源的中藥何首烏飲片進行檢測。采用Thermo fisher Accela UHPLC超高壓色譜系統(tǒng)。色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱(2.1mm×50 mm,1.7μm)。流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸水系統(tǒng)組成,梯度洗脫。系統(tǒng)程序為：13% A(0 min),35% bA(3.5 min), 90% A(7.5 min),95％A(8.5 min)和95% A(10 min),每次進樣前以初速流動相平衡4 min.流速為400μL/m in。柱溫為室溫。進樣量為5 μL。在線DAD檢測記錄200-400nm光譜數(shù)據(jù)。質(zhì)譜方法采用LTQ-Orbitrap高分辨多級質(zhì)譜聯(lián)用儀并通過ESI接口與液相部分相連。定性檢測采用子離子全掃描模式,通過對比保留時間、碎片離子豐度、碎片離子高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)用于定性檢測。定量采用SRM的方法,即選擇目標成分的母離子在離子阱內(nèi)進行二級反應監(jiān)測,選擇最高響應子離子進行監(jiān)測。其離子對選擇如下：gallic acid:m/z 169→125；emodin:m/z 269→225；THSG:m/z 405→243; Emodin-8-glu:m/z 431→269.4、應用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)系統(tǒng)研究何首烏在大鼠血液和尿液的代謝輪廓,利用相關(guān)文獻數(shù)據(jù)、診斷離子搜尋策略及高分辨多級質(zhì)譜信息從大鼠血液和尿液樣品中推測體內(nèi)成分。方法為：SD大鼠分尿液組、血液組和空白組。大鼠代謝籠適應性飼養(yǎng)一周,間隔1.5 h灌胃2次首烏提取液,每次劑量為2 mL/kg,空白組給予相應劑量生理鹽水。其中尿液組大鼠按第一次給藥時間計收集0.5 h-3 h尿液。血液組第二次給藥后間隔0.5 h眼眶靜脈采血,采血前10%水合氯醛麻醉,采血3次,分別為第二次給藥后30 min、1h、1.5 h.同時收集空白組尿液和血樣。所得血樣經(jīng)低速離心(5000rpm,10 min),取上層血漿,-80℃保存。血漿樣品經(jīng)有機溶劑沉淀法處理,尿液樣品經(jīng)甲醇蛋白沉淀,取上清液,濃縮至2 mL,加入2 mL乙腈-甲醇混合試劑(3：1),漩渦5 min,高速離心(15000 rpm,10 min)。取上清液,即得.液相部分采用Thermno-Fisher Accela UHPLC色譜系統(tǒng)。色譜柱為Phemomenex Kinetex C18(2.1×100mm ,2.6μm).流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸水系統(tǒng)組成,梯度洗脫。系統(tǒng)程序為：5% A(0 min),35% A(13.5 min),60% A(23.5 min),90% A(30 min),每次進樣前以初速流動相平衡4 mmin。流速為200μL/min。柱溫為室溫。進樣量為5μL。在線DAD檢測記錄200-400 nm光譜數(shù)據(jù)。質(zhì)譜部分采用LTQ-Orbitrap高分辨多級質(zhì)譜儀并通過ESI接口與液相部分相連,同前法采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。5、采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS對大鼠灌胃何首烏二苯乙烯苷和大黃素血藥濃度和藥代動力學進行了初步研究。SD大鼠SPF級動物房室溫環(huán)境下適應性飼養(yǎng)一周。按1 mL/100g劑量分別灌胃給予生首烏,另取空白組給予相應劑量生理鹽水用于采集空白血漿。并于給藥后5、10、15、20、30、45、60、120、240、480 min大鼠眼眶靜脈叢取血750 gL至1.5 mL EP管內(nèi)。所得血樣于3h內(nèi)經(jīng)4℃低速離心(5000rpm,10min),取上層血漿,-80℃保存。色譜柱采用Waters UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm).流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸水系統(tǒng)組成,梯度洗脫。系統(tǒng)程序為：8% A(0 min).30% A(3.5 min).85% A (7.5 min)、90%　A (8.5 min)、90% A (10 min)。流速為400 μL/min。柱溫為室溫。進樣量為5μL。質(zhì)譜定性檢測采用子離子高分辨全掃描模式,即選擇待測標準品二苯乙烯苷、大黃素和內(nèi)標物虎杖苷、白藜蘆醇的精確母離子m/z405、269、389、227進行二級質(zhì)譜高分辨全掃描,通過對比保留時間、碎片離子豐度、碎片離子高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)用于定性檢測。定量檢測采用Orbitrap高分辨選擇離子監(jiān)測模式(HR-SIM)。6、系統(tǒng)研究了附子代表性生物堿成分在UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn碎裂行為。方法為：采用直接持續(xù)進樣方式,進樣速度為3μL/min。質(zhì)譜全掃描范圍為m/z150-1500,高分辨全掃描分辨率設為30000(以m/z 400的半峰寬計),MS2-MS3采用Orbitrap高分辨掃描,掃描分辨率設為15000,MS4以后的子離子采用LTQ打拿極(dynote)檢測。選擇上一級最高峰進行下級碎裂掃描,碎裂方式為碰撞誘導解離(CID)方式,其碰撞能量為40%,選擇峰寬范圍為m/z±1,其他參數(shù)為默認。以特征離子信號和多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),輔以高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻證實,推測代表性附子生物堿在正離子模式下可能的裂解規(guī)律。7、使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù)對中藥附子化學成分進行了定性分析,利用模式成分的裂解規(guī)律,自建的二萜類生物堿質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻,建立了系統(tǒng)鑒定流程和策略,用于附子生物堿未知成分的檢測。結(jié)果：1、運用LTQ-Orbitrap高分辨多級質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)研究了何首烏主要成分二苯乙烯苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律。對其關(guān)鍵的離子碎裂位置進行了分析與模擬,高分辨質(zhì)譜證實m/z225、215、137子離子均源于A環(huán)的內(nèi)部碎裂形成的碎片,而m/z 149源于鏈接A、B環(huán)的烯鍵重排碎裂形成。這些關(guān)鍵的裂解途徑為從何首烏中尋找相似成分提供依據(jù)。運用LTQ-Orbitrap高分辨多級質(zhì)譜技術(shù)比較了幾種不同取代蒽醌類成分的特征碎裂模式,對形成的多個奇電子離子進行了歸屬。首次全面分析了兒茶素和表兒茶素在LTQ-Orbitrap質(zhì)譜中的裂解行為,為研究何首烏相關(guān)鞣質(zhì)及兒茶素衍生物的定性檢測提供依據(jù)。2、建立了基于何首烏及相關(guān)藥材的化學成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,并運用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù),結(jié)合模式成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律,對何首烏藥材化學成分進行分析,共鑒定或推測87個成分,包括15個二苯乙烯類成分、19個蒽醌類成分、13個鞣質(zhì)或沒食子酸衍生物、6個萘類成分等。首次從何首烏中發(fā)現(xiàn)28個新的蒽醌二聚體糖苷成分(二蒽酮苷),運用高分辨質(zhì)譜技術(shù)證實了何首烏中二蒽酮糖苷成分為emodin (10→10') emodin或emodin (10→10') physcion的母核。研究發(fā)現(xiàn)該類成分在ESI軟電離及CID碎裂下通過10-10’均裂形成特征性的奇電子離子,這是首次從何首烏中發(fā)現(xiàn)有大量二蒽酮成分的存在。3、縱觀國內(nèi)外文獻,創(chuàng)新性地運用液相與離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速測定何首烏4種代表性成分大黃素、大黃素-8-O-葡萄糖苷、沒食子酸和二苯乙烯苷含量的方法,并運用于20批不同產(chǎn)地、不同炮制來源的中藥何首烏飲片的檢測,結(jié)果表明線性離子阱質(zhì)譜用于定量方法開發(fā)具有快速靈敏的優(yōu)點,可用于何首烏及其相關(guān)制品的質(zhì)量控制：研究結(jié)果表明不同產(chǎn)地首烏指標性成分含量差異巨大,炮制后何首烏的多個指標成分含量明顯降低。4、首次應用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)系統(tǒng)研究何首烏在大鼠血液和尿液的代謝輪廓,利用相關(guān)文獻數(shù)據(jù)、診斷離子搜尋策略及高分辨多級質(zhì)譜信息從大鼠血液和尿液樣品中推測了45個體內(nèi)成分。包括5個原形成分和40個代謝成分。結(jié)果表明大鼠灌胃何首烏代謝成分以大黃素、二苯乙烯苷、大黃素甲醚的葡萄糖醛酸和硫酸酯化的二相代謝產(chǎn)物為主,此外還檢測到大黃素氧化與甲基化、二苯乙烯苷糖苷鍵水解和烯鍵的還原的一相代謝產(chǎn)物。5、采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS對大鼠灌胃何首烏二苯乙烯苷和大黃素血藥濃度和藥代動力學進行了初步研究。創(chuàng)新性地采用超高分辨SIM模式建立了二苯乙烯苷和大黃素的體內(nèi)定量檢測方法,結(jié)果表明Orbitrap高分辨SIM模式具有去干擾能力強、檢測靈敏度高、快速簡便的優(yōu)點,通過LTQ-Orbitrap定性結(jié)合定量研究中藥復雜體系的藥代動力學和系統(tǒng)描繪中藥體內(nèi)代謝輪廓具有一定的優(yōu)勢。6、系統(tǒng)研究了附子代表性生物堿成分在UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn碎裂行為。以特征離子信號和多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),輔以高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻證實,推測代表性附子生物堿在正離子模式下可能的裂解規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),在二萜類生物堿C1、C3和C16等取代基位置為LTQ-Orbitrap質(zhì)譜優(yōu)先裂解的位點,在多級質(zhì)譜中脫水與C3-OH有關(guān),而特征性的CO中性丟失與C16位羥基重排有關(guān),附子原堿成分的二級質(zhì)譜形成的基峰可用來區(qū)分它們的C1、C3位取代模式。這些不同類型附子生物堿的特征質(zhì)譜裂解規(guī)律和特征碎片離子有利于對附子未知生物堿的鑒定和結(jié)構(gòu)分析。7、使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù)對中藥附子化學成分進行了定性分析,利用模式成分的裂解規(guī)律,自建的二萜類生物堿質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻,建立了系統(tǒng)鑒定流程和策略,檢出120余個附子生物堿成分,包括首次報道的MDA、LDA和ADA類成分,基本闡明了中藥附子的化學物質(zhì)基礎(chǔ),為今后的化學成分研究、指紋圖譜及質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。結(jié)論：本文以兩種常見中藥何首烏和附子為對象,針對中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究相關(guān)的中藥化學成分與體內(nèi)成分的定性定量方法的難點問題,采用超高壓液相與高分辨多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),開展中藥化學物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)吸收代謝物質(zhì)基礎(chǔ)和藥代動力學研究,系統(tǒng)揭示了何首烏、附子兩味中藥的化學物質(zhì)基礎(chǔ)。為中藥的體內(nèi)外成分的在線快速檢測提供方法學借鑒。為中藥現(xiàn)代化研究探索可行的技術(shù)和方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R284.1;O657.63

【參考文獻】

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本文編號：2214789