【摘要】：在脊髓缺血再灌注損傷造成的遲發(fā)性癱瘓中，神經元凋亡是細胞死亡的主要方式，是造成治療困難、療效不明顯的重要原因之一。ASK1-JNK/P38MAPK途徑是調節(jié)細胞凋亡的重要信號傳導途徑，抑制ASK1信號通路可減少細胞凋亡的發(fā)生。人參皂甙Rd是人參的主要成份之一，既往實驗表明Rd對缺血性腦卒中具有明確的神經保護作用，對于同屬中樞神經系統(tǒng)的脊髓組織，Rd是否同樣發(fā)揮保護作用，至今未見報道。本實驗通過建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，觀察腹腔注射Rd后大鼠后肢運動功能改善程度、組織病理變化及神經細胞凋亡情況，探討Rd對脊髓缺血再灌注損傷是否具有神經保護作用，以及這種作用是否與抑制神經細胞凋亡有關，為進一步明確Rd的藥理作用及應用于臨床治療提供實驗依據。 目的： 觀察人參皂甙Rd對SD大鼠脊髓缺血再灌注損傷后運動功能的改善情況并通過行為學分析、特殊染色、免疫組織化學染色、Western blot等方法相結合，揭示其可能的分子機制。 方法： 1、確定最佳治療劑量 隨機選擇SD大鼠30只，分為假手術組（Sham組）、缺血/再灌注損傷組（I/R組）、6.25mg/kg Rd組、12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組，每組5只；其中6.25mg/kg Rd組、12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組為治療組。假手術組，僅打開腹腔，不夾閉腹主動脈；I/R組，麻醉后切開大鼠腹腔，用動脈夾阻斷腎動脈水平以下腹主動脈60分鐘后關腹，建立脊髓缺血/再灌注損傷模型；治療組，按照I/R組方法造成脊髓缺血/再灌注損傷模型，6.25mg/kg Rd組，每只鼠按照6.25mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射；12.5mg/kg Rd組，每只鼠按照12.5mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射；25mg/kg Rd組，每只鼠按照25mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射；50mg/kg Rd組，每只鼠按照50mg/kg·d劑量給予人參皂甙Rd腹腔注射。模型建立后每日觀察SD大鼠后肢及尾部運動情況，進行BBB評分。全部30只SD大鼠于術后第5日處死，小心剝離胸13水平以下的脊髓組織，置于10%中性福爾馬林液4℃固定24小時，以腰2為中心修塊，長度3.0mm，常規(guī)石蠟包埋、固定，石蠟切片，蘇木精-伊紅染色（HE染色），根據實驗結果確定最佳治療劑量。 2、確定最佳治療時間 隨機選擇SD大鼠20只，分為建模后1天組、建模后3天組、建模后5天組、建模后7天組，每組5只；四組均建立脊髓缺血再灌注損傷模型，具體方法同前，術后每日觀察SD大鼠下肢及尾部運動情況，進行BBB評分，根據上一步實驗結果，各組每日均給予相同劑量（即前一步確定的最佳劑量25mg/kg·d）Rd腹腔注射；分別于建模后不同時間處死各組SD大鼠，取出脊髓組織進行HE染色，方法同上，根據BBB評分及染色結果來確定最佳治療時間。具體情況為建模后1天組于建模后第1日處死，建模后3天組于建模后第3日處死，建模后5天組于建模后第5日處死；建模后7天組于建模后第7日處死。 3、大鼠脊髓切片的尼氏染色和Caspase3染色 尼氏染色法：石蠟切片常規(guī)脫蠟，0.25%的甲苯胺藍50℃3小時，脫色，脫水，，透明，中性樹膠封片。采用OLYMPUSBX53顯微鏡(Olympus)觀察，并用CellSens Dimension攝像系統(tǒng)(Olympus)顯微攝影。所得圖片采用Image-Pro Plus6.0軟件進行圖像分析，并測得其灰度值。Caspase3染色方法：石蠟切片脫蠟和水化后，過氧化酶阻斷溶液孵育，正常非免疫動物血清孵育后，每張切片加50μl羊抗鼠Caspase3抗體（稀釋度1：250）孵育60min，生物素標記的抗羊免疫球蛋白試劑（試劑盒自帶）孵育，鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液孵育，新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察，蘇木素復染，返藍；梯度酒精脫水、透明，中性樹膠封固。免疫組織化學染色的標本中，Caspase3陽性神經細胞的細胞質內含棕色顆粒，非陽性神經細胞的細胞質內無棕色顆粒。統(tǒng)計脊髓灰質內陽性神經細胞數和神經細胞總數。計算Caspase3表達的陽性率，Caspase3表達的陽性率=陽性神經細胞數/神經細胞總數×100%。Caspase3的表達情況是由陽性細胞的百分率和陽性細胞表達強度共同決定的，陽性細胞百分率的得分是0（0%），1（1-10%），2（11-50%），3（51-80%），4（80%）；表達強度的得分是1（弱度），2（中度），3（強度）。最后的得分是表達率與表達強度得分的總和，總得分可以分為以下幾組：不表達（得分2），低表達（得分=2-3），中表達（得分=4-5），高表達（得分=6-7）。 4、Western blot方法檢測p38MAPK、ASK1、JNK 隨機選擇SD大鼠24只，分為對照組（Control組）、假手術組（Sham組）、缺血/再灌注損傷組（I/R組）、治療組（Treat組），每組6只。Control組，僅給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，不打開腹腔，術后每日腹腔注射生理鹽水；Sham組，僅打開腹腔后關腹，術后每日腹腔注射生理鹽水；I/R組，采用前述方法造成脊髓缺血再灌注損傷，術后不給予人參皂甙Rd，每日只給予腹腔注射生理鹽水；Treat組，建模方法同I/R組，參考前述實驗確定的最佳治療劑量和最佳治療時間結果，每日給予人參皂甙Rd腹腔注射進行治療。全部24只SD大鼠均于同一時間處死。游離出脊髓組織，置于勻漿器中裂解，勻漿并離心后測蛋白濃度。應用蛋白測定試劑盒繪制標準蛋白曲線，根據測得的樣品濃度，將樣品稀釋為統(tǒng)一濃度后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉膜。加入WB二抗進行免疫反應，化學發(fā)光、顯色、定影，圖像分析。采用Tanon Gel Image SystemID4.1.2系統(tǒng)進行圖像攝影并分析。 結果： 1、通過結合各組大鼠BBB評分和HE染色切片評分，確定Rd的最佳治療劑量為25mg/kg·d。各組大鼠BBB評分的比較采用重復測量方差分析，組間比較（F=220.03,P0.001），不同時間比較（F=213.52, P0.001），劑量與時間存在交互作用（F=19.83,P0.001）。組間兩兩比較采用SNK檢驗，Sham組與其他5組比較均有差別（P0.05），且Sham組評分均數最高（X=20.9）；I/R組與其他4組比較均有差別（P0.05），且I/R組評分均數最低（X=11.1）；除6.25mg/kg Rd組與12.5mg/kg Rd組之間、25mg/kgRd組與50mg/kg Rd組之間比較無差別（P0.05），治療組（6.25，12.5，25，50mg/kgRd組）各組之間均有差別（P0.05），且各組隨Rd腹腔注射劑量增加，BBB評分有逐漸增高的趨勢，6.25，12.5，25，50mg/kg Rd組每組BBB評分均數分別為（X=13.0,13.1,15.3,15.4），說明人參皂甙Rd的劑量與BBB評分的改善之間存在效應-劑量關系。在術后不同時間比較中，治療組隨Rd腹腔注射劑量增加，除6.25mg/kg Rd組術后第1、2天之間比較無差別（P0.05），其余Rd組術后第1、2、3、4天之間比較均有差別（P0.05），治療組每個劑量組在第4、5天之間比較無差別（P0.05），提示到第4天后，BBB評分進入一個平臺期。各組HE染色切片評分結果比較采用單因素方差分析（F=32.25, P0.001），組間兩兩比較采用SNK檢驗。除25mg/kg Rd組與50mg/kg Rd組比較無差別（P0.05）外，其余任意兩組之間均有差別（P0.05）。故選擇最佳治療劑量為25mg/kg·d。 2、通過結合各組大鼠BBB評分和HE染色切片評分，確定Rd的最佳治療時間為5天。建模后7天組不同時間的BBB評分比較采用單因素方差分析（F=4.55, P=0.002），組間兩兩比較采用SNK檢驗，除術后第1天與第4、5、6、7天之間比較有差別（P0.05）外，其余任意兩組之間比較均無差別（P0.05）。說明治療有效；HE染色切片顯示微觀結構改變與行為學表現的改善相一致，脊髓組織的缺血再灌注損傷明顯減輕。對各組HE染色切片評分比較，采用單因素方差分析（F=3.66, P=0.035），組間兩兩比較采用SNK檢驗，建模后5天組與建模后1天組、建模后3天組比較均有差別（P0.05），與建模后7天組比較無差別（P0.05）；建模后1天組與建模后3天組、建模后7天組比較無差別（P0.05）；建模后3天組與建模后7天組比較無差別（P0.05）。故選擇最佳治療時間為5天。 3、尼氏染色與Caspase3染色結果提示Rd對脊髓缺血再灌注損傷的神經保護作用主要與治療劑量相關。尼氏染色結果顯示在Sham組，脊髓前角運動神經元體積較大，細胞核染色淺，核仁清晰，細胞質中尼氏體含量較多。I/R組；脊髓前角運動神經元體積較大，細胞核染色淺，核仁清晰，細胞質內尼氏體邊集，且染色深，6.25mg/kg Rd組：脊髓前角運動神經元細胞核染色淺，核仁清晰，細胞質內尼氏體含量較多，但較缺血組有所減少，且染色不如缺血組的尼氏體染色深。12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kgRd組：脊髓前角運動神經元細胞核染色淺，核仁清晰，細胞質內尼氏體含量多。測得的灰度值兩組間比較采用配對t檢驗，Sham組與I/R組、6.25mg/kg Rd組、12.5mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組相比較，差別有顯著性（P0.05）；6.25mg/kg Rd組與I/R組相比較，差別有顯著性（P0.05）；12.5mg/kg Rd組與6.25mg/kg Rd組、25mg/kg Rd組與12.5mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組與25mg/kg Rd組相比較，差別無顯著性（p0.05）。建模后1天組，建模后3天組，建模后5天組，建模后7天組，尼氏染色結果顯示各組脊髓前角運動神經元細胞核染色淺，核仁清晰，細胞質內尼氏體含量多，隨治療時間延長，測量其灰度值變化，差別無顯著性（p0.05）。Caspase3染色結果評分后，兩組間比較采用配對t檢驗，I/R組評分與Sham組差異有顯著性（p0.01），I/R組可見Caspase3陽性顆粒，說明部分神經元細胞在脊髓缺血再灌注損傷后發(fā)生了凋亡；給予腹腔注射Rd治療后，6.25mg/kg Rd組評分與I/R組評分比較，差異有顯著性（p0.01），I/R組高于6.25mg/kg Rd組，說明治療有效；隨著Rd濃度的增加，12.5mg/kgRd組評分與6.25mg/kg Rd組評分比較，差異仍有顯著性（p0.05），6.25mg/kg Rd組高于12.5mg/kg Rd組，說明Rd對Caspase3表達的抑制作用呈濃度依賴式；隨著Rd濃度再進一步增加，25mg/kg Rd組、50mg/kg Rd組的評分與Sham組比較，差異已無顯著性（p0.05），說明經Rd積極治療后，Caspase3的表達已經很少，甚至無表達。而在建模后1天組、建模后3天組、建模后5天組、建模后7天組，Caspase3染色結果提示，神經元細胞大，細胞核圓，神經細胞的細胞質內無Caspase3陽性顆粒生成，各組比較差異無顯著性（p0.05）。這一結果說明，在給予特定濃度Rd治療的情況下，隨著治療時間延長，Caspase3陽性細胞變化不明顯，提示Caspase3的表達對Rd的濃度變化較為敏感，對治療時間不敏感。 4、Western blot結果顯示Rd主要是通過ASK1-JNK途徑抑制脊髓缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡的發(fā)生，而非p38MAPK。對于ASK1和JNK，I/R組與Sham組相比較，差異有顯著性（p0.01），說明模型建立成功；Treat組與I/R組相比較，差異有顯著性（p0.05），說明腹腔注射Rd治療有效，ASK1、JNK表達均下降。對于p38MAPK，I/R組與Sham組相比較，差異具有顯著性（p0.01），說明模型建立成功；Treat組與I/R組相比較，差異無顯著性（p0.05），說明Rd主要是通過ASK1-JNK途徑發(fā)揮神經保護作用，而非p38MAPK。 結論： 人參皂甙Rd對于大鼠脊髓缺血再灌注損傷后運動功能障礙可發(fā)揮明確的神經保護作用，腹腔注射Rd不僅可以明顯改善大鼠的后肢運動功能（BBB評分），改善微觀組織結構病理性損害（HE染色），還可以減少神經元凋亡；尼氏染色與Caspase3染色結果提示，Rd主要以劑量依賴方式來發(fā)揮作用，抑制Caspase3的表達，對治療時間的變化不敏感；Rd通過抑制神經細胞凋亡來發(fā)揮神經保護作用，與Rd對ASK1信號通路的表達抑制相關，主要是通過ASK1-JNK途徑，減少Caspase3的表達，而不是ASK1-p38MAPK途徑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 趙慶華;賈連順;周許輝;宋滇文;;大鼠脊髓缺血再灌注損傷后MMP-9的基因表達變化[J];頸腰痛雜志;2007年03期

2 楊淵,張?zhí)K明,方思羽,張e

本文編號：2191753