本文選題：真皮乳頭細(xì)胞 + 毛發(fā)誘導(dǎo)能力��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景毛囊是由上皮部分和真皮部分組成,這兩種成分的細(xì)胞的相互作用在毛囊的形成與生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要的作用。毛囊的上皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞之間的復(fù)雜的交流與作用被認(rèn)為是促進(jìn)毛囊再生及維持毛囊正常發(fā)育生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。雖然毛囊的形成涉及到這兩種細(xì)胞發(fā)出的一系列復(fù)雜并相互影響的信號(hào),但一般來(lái)說(shuō),真皮部分的細(xì)胞被認(rèn)為是引導(dǎo)者,而毛囊上皮細(xì)胞被認(rèn)為是應(yīng)答者。毛囊上皮部分包括外根鞘、內(nèi)根鞘、毛母質(zhì)和毛干,這些上皮成分均由位于毛囊隆凸部位的上皮干細(xì)胞產(chǎn)生。毛母質(zhì)內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞被稱(chēng)為是“毛干的生長(zhǎng)工廠”,這些角質(zhì)細(xì)胞具有短暫快速增殖的能力,它們受毛囊內(nèi)真皮乳頭細(xì)胞釋放的一系列信號(hào)因子的刺激,可快速增殖并分化為毛干等結(jié)構(gòu)。毛囊真皮部分又被分為真皮乳頭和真皮鞘。真皮乳頭位于毛囊的底部,與周?chē)拿纲|(zhì)上皮部分相鄰,被真皮鞘環(huán)繞包裹,僅通過(guò)基底的莖突與真皮鞘相連。真皮乳頭內(nèi)儲(chǔ)存有大量毛乳頭細(xì)胞,真皮乳頭細(xì)胞分泌一系列細(xì)胞因子來(lái)影響與其相鄰毛母質(zhì)內(nèi)角質(zhì)上皮細(xì)胞的增殖及分化,繼而影響毛囊生長(zhǎng)并調(diào)控毛囊的生長(zhǎng)周期。因此真皮乳頭細(xì)胞在毛囊的生長(zhǎng)中發(fā)揮著核心的調(diào)控作用。由于真皮乳頭細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力對(duì)于毛囊再生與生長(zhǎng)至關(guān)重要,因此模擬細(xì)胞外環(huán)境以保留甚至恢復(fù)真皮乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)能力的模型日益得到人們的重視,這些模型主要分為體內(nèi)毛囊重建模型和體外毛囊培養(yǎng)模型。體內(nèi)動(dòng)物模型又包括注射法、小室法和皮瓣法,總的原理是將真皮乳頭細(xì)胞和上皮干細(xì)胞相混合,再用不同方法移植入裸鼠體內(nèi),觀察體內(nèi)毛囊重建與生長(zhǎng)情況,從而模仿了真皮乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊再生所需的體內(nèi)環(huán)境。但無(wú)論是注射法、小室法和皮瓣法均有各自的缺陷,使真皮乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力受到了一定程度的損害并繼而影響毛囊的重建。小室法是在裸鼠背部創(chuàng)造一個(gè)肉芽創(chuàng)面,然后將乳鼠上皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞的混合物放入該創(chuàng)面上,大約在23天后可明顯看到毛干長(zhǎng)出,毛發(fā)質(zhì)量和密度與正常無(wú)異常。雖然小室法產(chǎn)生的毛囊形態(tài)最佳,但是這種模型耗費(fèi)的細(xì)胞數(shù)量最多,而且操作相對(duì)復(fù)雜。皮瓣法能產(chǎn)生與小室法類(lèi)似的毛發(fā)效果,如毛干質(zhì)量與密度,但是最早至少需要29天才能產(chǎn)生毛囊,這種方法需要的細(xì)胞量比小室法要少,但是需要行兩次外科手術(shù)治療,動(dòng)物失血較多。注射法產(chǎn)生數(shù)量最少的毛發(fā),這是因?yàn)?不像前兩種方法,小室法將細(xì)胞混合物被放入解剖位置不正常的部位,即真皮致密層,形成大小不等的囊狀物,這些囊狀物容易破裂并導(dǎo)致排斥反應(yīng),大多數(shù)最終纖維化,很少有毛發(fā)長(zhǎng)出。盡管如此,這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于它需要的細(xì)胞量最少,并且省力省時(shí),容易快速產(chǎn)生少量毛囊。體內(nèi)模型雖然可在體內(nèi)原位研究毛囊,并且可用具體形態(tài)觀察、免疫組織化學(xué)、來(lái)觀察毛囊變化,但是難以對(duì)單個(gè)毛囊的體外壞境予以精確控制,從而難以準(zhǔn)確闡述單個(gè)細(xì)胞因子在毛囊生長(zhǎng)中所起的作用。細(xì)胞培養(yǎng)包括分離和培養(yǎng)單種細(xì)胞群,使細(xì)胞的形態(tài)、生化和分子參數(shù)可以被測(cè)量,然而細(xì)胞培養(yǎng)導(dǎo)致毛囊組織三維立體結(jié)構(gòu)的喪失,使細(xì)胞培養(yǎng)不能準(zhǔn)確地反映出整個(gè)器官的真實(shí)情況。毛囊器官培養(yǎng)彌補(bǔ)了細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn),同時(shí)保留了組織的完整結(jié)構(gòu)。完整毛囊的器官培養(yǎng)能最大限度地模仿毛囊真皮乳頭細(xì)胞的生態(tài)壞境及真皮乳頭立體結(jié)構(gòu),從而在一定程度上保留了真皮乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力。利用毛囊器官培養(yǎng)模型,我們可以準(zhǔn)確檢測(cè)外界不同藥物或生長(zhǎng)因子對(duì)真皮乳頭細(xì)胞的影響。但目前毛囊器官培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基尚不能完全模仿體內(nèi)環(huán)境,與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)相比,雖然器官培養(yǎng)的毛囊內(nèi)真皮乳頭細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力得到了一定程度的保留,但仍然在培養(yǎng)中不斷喪失,影響了毛囊的生長(zhǎng)。本研究擬從兩方面進(jìn)行研究,一是改良將真皮乳頭細(xì)胞移植入動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?從而為真皮乳頭細(xì)胞盡可能提供良好的體內(nèi)環(huán)境,以促進(jìn)毛囊的重建與生長(zhǎng)；二是改良毛囊體外培養(yǎng)所需的環(huán)境,即培養(yǎng)基,使毛囊內(nèi)的真皮乳頭細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力盡可能得到保留。該研究結(jié)果對(duì)于毛發(fā)體內(nèi)再生重建和治療各類(lèi)毛發(fā)生長(zhǎng)缺陷性疾病提供了重要的理論和臨床實(shí)際意義。目的1設(shè)計(jì)一種更簡(jiǎn)便、更有效的動(dòng)物模型,使移植入動(dòng)物體內(nèi)的真皮乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力得到最大限度的保留,從而促進(jìn)體內(nèi)毛囊重建。2改良毛囊器官培養(yǎng)的外壞境,即培養(yǎng)基,以恢復(fù)毛囊真皮乳頭細(xì)胞的部分誘導(dǎo)能力,從而使體外培養(yǎng)的毛囊的增殖期延長(zhǎng)。方法1.裸鼠體內(nèi)毛囊重建模型的改良1.1毛囊上皮組織與毛囊真皮細(xì)胞的制備：將出生24小時(shí)內(nèi)的C57BL/6J小鼠處死,用75%酒精浸泡消毒后取其背部全層皮膚,然后用PBS液反復(fù)潤(rùn)洗,去除多余脂肪,放入含1%中性蛋白酶的DMEM消化液中,在4℃下消化過(guò)夜。次日將已消化過(guò)夜的皮膚取出,用鑷子可輕易分離上皮與真皮組織。將完整的上皮片臨時(shí)放入含10%小牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培養(yǎng)液(DMEM/10)的培養(yǎng)皿中待用。用顯微剪反復(fù)地將真皮組織剪成細(xì)小顆粒狀,然后放入0.2%膠原酶中在37℃下消化1小時(shí)。消化結(jié)束后,加入等量的DMEM/10,然后依次用100微米和40微米的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾,將所得的細(xì)胞懸液在200g下離心5分鐘,再將細(xì)胞沉淀塊重新懸浮于1毫升的DMEM/10液體中并計(jì)數(shù)。最后再次將細(xì)胞懸液離心并懸浮于20微升的DMEM/10中,使成泥漿狀。1.2設(shè)計(jì)改良皮瓣法動(dòng)物模型：將1.5毫升離心管蓋子取下,修剪成一個(gè)約1.5cm2大小的圓形硅膠板。將制備的上皮片角質(zhì)層覆蓋在硅膠板的光滑面,使真皮面朝上。用微型吸管將泥漿樣的真皮懸液涂抹于上皮片的真皮面。將載有上皮片及真皮細(xì)胞的硅膠板放于37-℃的CO2孵箱中,蒸發(fā)掉多余的水分。將4-5周大的裸鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥液麻醉,背部用0.5%聚維酮碘液消毒。在背部近臀部設(shè)計(jì)一切口線,切開(kāi)皮膚潛行分離皮下,使行成一個(gè)能容納假體的空間,將載有上皮片及真皮細(xì)胞的硅膠板移植入已分離的皮下,再將切口縫合。1.3為進(jìn)行對(duì)比,我們同時(shí)進(jìn)行了傳統(tǒng)皮瓣法的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在裸鼠背部行三邊切口(約0.8×1 cm),掀起整個(gè)皮膚層,植入一個(gè)載有上皮片及真皮細(xì)胞的薄層軟硅膠片(約2.5×.5 cm),上皮片的真皮面同樣朝上,其余步驟同改良皮瓣法。1.4打開(kāi)皮瓣觀察毛發(fā)生長(zhǎng)情況：當(dāng)背部皮膚明顯隆起并且顏色變黑時(shí),我們?cè)O(shè)計(jì)三邊切口,切開(kāi)皮膚打開(kāi)皮瓣,向后翻轉(zhuǎn)使其暴露在外界環(huán)境中,再拉攏周?chē)那锌诓㈤g斷縫合以閉合創(chuàng)面。1.5移植細(xì)胞的追蹤： 為評(píng)估移植入裸鼠體內(nèi)的上皮細(xì)胞,我們選擇用GFP轉(zhuǎn)基因的C57BL/6J小鼠的背部上皮細(xì)胞片。為追蹤真皮細(xì)胞,我們用dilinoleyltetramethylindocarbocyanine perchlorate (Dil),一種橙紅色細(xì)胞膜熒光染料,來(lái)對(duì)真皮細(xì)胞進(jìn)行染色,再將其移植入裸鼠體內(nèi)。GFP上皮片與普通乳鼠真皮細(xì)胞混合后移植,Dil染色的真皮細(xì)胞與普通乳鼠來(lái)源的上皮細(xì)胞片混合移植。1.6毛發(fā)生長(zhǎng)的評(píng)估：毛發(fā)生長(zhǎng)的評(píng)估分別通過(guò)外觀和組織學(xué)(HE染色石蠟切片及電鏡檢查)來(lái)觀察。2.毛囊器官培養(yǎng)液的改良—溶菌酶在毛囊中的表達(dá)及對(duì)毛囊體外生長(zhǎng)的影響2.1毛囊生長(zhǎng)周期中的溶菌酶表達(dá)變化：分別將處于增殖期和衰退期的毛囊用4%多聚甲醛固定,然后用石蠟包埋、切片(厚度4gm),抗原還原處理后,分別用溶菌酶一抗(兔來(lái)源抗鼠,貨號(hào)：SAB 1306215,1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和相應(yīng)第二抗體處理組織切片。然后DAB加蘇木精染色顯色。2.2毛囊體外培養(yǎng)：選擇4-5周大的C57BL/6J小鼠,從其觸須墊部位顯微分離出觸須毛囊,從中選擇處于增殖期的毛囊并將其放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)基包括500μ1 Williams E培養(yǎng)液,濃度為2 mM L-谷氨酰胺,10 mg/ml的胰島素,10g/ml的氫化可的松和經(jīng)稀釋100倍的青霉素與鏈霉素雙抗液。每次試驗(yàn)將40根毛囊平均分成4組,分別加入溶菌酶1,5,10 μg/ml或者不加溶菌酶。試驗(yàn)共重復(fù)3次。2.3毛囊的毛干增加長(zhǎng)度與生長(zhǎng)周期的測(cè)量：我們使用倒置顯微鏡(IX71；Olympus Optical Co.Ltd, Tokyo,Japan)分別在第0,1和3天拍照,觀察毛囊生長(zhǎng)周期的變化。2.4 Ki-67 and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)雙熒光染色：為了追蹤毛囊內(nèi)上皮干細(xì)胞的增殖情況,我們?cè)诿殷w外培養(yǎng)結(jié)束前12小時(shí)在培養(yǎng)基中加入10 μM的BrdU。培養(yǎng)結(jié)束后我們挑選出仍處于增殖期的毛囊,放入4%多聚甲醛中固定24小時(shí),石蠟包埋,切成4μm厚的薄片,經(jīng)抗原修復(fù)后,在4℃下用抗BrdU和Ki-67的混合一抗(兔抗小鼠Ki-67,貨號(hào)：AB9260,1:1000;Millipore, Bedford, MA,USA和大鼠抗小鼠BrdU,貨號(hào)：ab6326,1:100;Abcam, Cambridge, MA,USA)孵育組織切片。接下來(lái)用相應(yīng)熒光二抗處理組織切片。細(xì)胞核再用4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)復(fù)染。2.5毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)：毛乳頭從C57BL/6J鼠觸須毛囊的毛球部分離獲得,再將毛乳頭放入含4型膠原酶的培養(yǎng)皿中消化3小時(shí),然后放入含100 U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和20%小牛血清的DMEM中,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取出的毛乳頭共培養(yǎng)5天,每3天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)接近至融合狀態(tài)時(shí),將其以1：3的比例進(jìn)行傳代。獲得的毛乳頭細(xì)胞暫放入DMEM/10液中等待下一步使用。2.6蛋白免疫印跡法：將培養(yǎng)2代的毛乳頭細(xì)胞用5和10μg/ml的溶菌酶處理24小時(shí),然后用RIPA裂解液提取所有蛋白,然后使用10%SDS-PAGE將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,將膜分別用一抗在4℃下孵育過(guò)夜。一抗包括：兔抗小鼠LEF1,貨號(hào)：ab85052,1:400;Abcam).兔抗小鼠堿性磷酸酶(ALP),貨號(hào)：sc-30203,1:1000;SantaCruz Biotechnology),和兔抗小鼠β-actin(ab8227, 1:1000;Abcam)。然后將膜用對(duì)應(yīng)的二抗在室溫下孵育1小時(shí)。免疫復(fù)合物用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics,Silver Spring, MD, USA)對(duì)條帶光密度值進(jìn)行分析。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(x±SEM)。對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),兩組間數(shù)據(jù)比較采用unpaired t-test。對(duì)于毛囊器官培養(yǎng)的數(shù)據(jù)分析,多組之間的數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA分析,先檢驗(yàn)方差是否相齊,若方差相齊,兩兩比較用Bonferroni test分析,方差不齊則應(yīng)用welch分析。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.與傳統(tǒng)皮瓣法相比,經(jīng)過(guò)我們改良的皮瓣法操作步驟更為簡(jiǎn)化,動(dòng)物在術(shù)中失血更少,術(shù)后不僅能產(chǎn)生正常形態(tài)和密度的毛發(fā),而且能明顯縮短真皮乳頭細(xì)胞在體內(nèi)誘導(dǎo)毛囊重建所需的時(shí)間。2.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶主要表達(dá)在增殖期毛囊的真皮部位(真皮乳頭和真皮鞘),而在衰退期的表達(dá)明顯減弱,不僅如此,在器官培養(yǎng)液中加入適量的溶菌酶,能明顯恢復(fù)真皮乳頭細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力,從而延長(zhǎng)毛囊的增殖期,促進(jìn)毛囊毛干的生長(zhǎng)。結(jié)論1.本研究通過(guò)改良皮瓣法模型,改善了移植入體內(nèi)的真皮乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境,提高了其毛發(fā)誘導(dǎo)能力,使毛發(fā)的形成時(shí)間大大縮短。2.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶具有促進(jìn)毛囊在體外生長(zhǎng)的能力。3.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶可恢復(fù)培養(yǎng)的真皮乳頭細(xì)胞的部分毛發(fā)誘導(dǎo)性,從而促進(jìn)毛囊在體外的生長(zhǎng)。
[Abstract]:background hair follicles are composed of epithelial and dermal parts which play an important role in the formation and growth of hair follicles . The dermal papilla cells are divided into dermal papilla cells and dermal sheaths . The present study intends to study the effect of different drugs or growth factors on dermal papilla cells .
A simple and effective animal model was designed to remove excess fat , and then put into DMEM / 10 medium containing 1 % neutral protease . In order to evaluate the growth of hair follicles , we studied the expression of lysozyme in the hair follicle and then transplanted them into nude mice .
The cells were incubated at 37 鈩，

本文編號(hào)：2045500