發(fā)布時間：2018-06-14 09:13

  本文選題：Draxin + DCC��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 成功建立脊髓背側(cè)半橫切模型，觀察軸突生長導(dǎo)向因子draxin在脊髓損傷不同時期的表達變化及其在損傷脊髓中的表達位置，為其在臨床脊髓損傷疾病中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法： 1動物及分組：2月齡體重約35g小鼠100只，按背側(cè)脊髓半橫切方式建立脊髓損傷模型，根據(jù)Reuter感覺功能評價方法，確定脊髓損傷背側(cè)半橫切模型建立成功。脊髓損傷模型隨機分為正常未損傷組、損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷4天組、損傷5天組、損傷6天組和損傷7天組，各10只,分別用于RT-PCR和Western Blot檢測。其余損傷小鼠模型分成損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷5天組，各5只，用于損傷后脊髓組織免疫組織化學(xué)抗draxin抗體染色觀察，或用于免疫組織化學(xué)抗draxin抗體、抗DCC抗體雙染觀察。 2mRNA提取及RT-PCR：正常未損傷組、損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷4天組、損傷5天組、損傷6天組和損傷7天組每組各取5只，10%水合氯醛麻醉后冰上迅速取下?lián)p傷節(jié)段脊髓，去除椎骨，暴露脊髓組織，DEPC水配制的PBS清洗后，將組織迅速轉(zhuǎn)移至Trizol中，常規(guī)提取mRNA，用NanoDrop2000C進行定量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存，用于PCR。 3蛋白提取及Western Blot：正常未損傷組、損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷4天組、損傷5天組、損傷6天組和損傷7天組每組各取5只，10%水合氯醛麻醉后冰上迅速取下?lián)p傷節(jié)段脊髓，去除椎骨，暴露脊髓組織，普通PBS清洗后迅速轉(zhuǎn)移至裂解液中，充分勻漿后于冰上靜置30min，12000rpm，4℃離心20min，取上清棄沉淀，小部分上清液用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，其余部分上清液置于-80℃冰箱儲存，用于Western Blot檢測。 4組織制備及免疫組織化學(xué)染色觀察：損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷5天組，每組各取5只。將小鼠麻醉并暴露心臟，將輸液針刺入左心室，同時用剪刀挑開右心耳，迅速生理鹽水沖洗，至無血后，用4%多聚甲醛進行灌注。取損傷節(jié)段脊髓組織，PBS清洗干凈，冷4%多聚甲醛固定2h，放入含30%蔗糖的PBS中充分沉降，取出組織OCT包埋，-80℃保存，用于免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果： 1成年期小鼠脊髓損傷后不同時期draxin mRNA的表達變化 成年期小鼠draxin mRNA在無損傷正常脊髓、損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后4天、損傷后5天、損傷后6天、損傷后7天的脊髓組織中均有表達。隨著時間的推移逐漸增高，損傷后第3天出現(xiàn)了一個表達高峰，后又表達下降。IOD數(shù)值在不同的檢測時段有顯著的差異(P＜0.05)，組間兩兩比較，，損傷后3天與其他組有顯著的差異（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義。 2成年期小鼠脊髓損傷后不同時期draxin蛋白的表達變化 成年期小鼠draxin蛋白在無損傷正常脊髓、損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后4天、損傷后5天、損傷后6天、損傷后7天的脊髓組織中均有表達。隨著時間的推移draxin蛋白的表達逐漸增高，并在損傷后第3-5天出現(xiàn)了一個表達高峰，后其表達又有所下降。IOD數(shù)值在不同的檢測時段有顯著的差異(P＜0.05)，組間兩兩比較，損傷后3-5天與其他組有顯著的差異（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義。 3Draxin蛋白在成年期小鼠損傷脊髓中的表達位置及其變化 Draxin陽性區(qū)域，熒光染色呈紅色。Draxin紅色信號集中于損傷切口的周邊。并且在損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后5天不同時間階段，表達量呈損傷后1到5天逐漸增多趨勢，表達高峰集中于損傷后3-5天。 4Draxin受體DCC在成年期小鼠損傷脊髓中的表達 DCC為draxin受體之一。Draxin陽性區(qū)域，熒光染色呈紅色；DCC陽性區(qū)域，熒光染色呈綠色。Draxin紅色信號和DCC綠色信號表達位置都集中于切口周邊，且draxin蛋白與DCC蛋白表達位置一致，圖中呈暗黃色區(qū)域。 結(jié)論： 1Draxin mRNA和draxin蛋白在成年期小鼠正常脊髓組織中表達，表達含量微少，損傷后被誘導(dǎo)增多。 2在成年期小鼠脊髓損傷的不同時間階段，draxin的表達量不同，脊髓損傷后1-7天的不同時間內(nèi)，出現(xiàn)了draxin mRNA和draxin蛋白損傷后3-5天的表達高峰。 3Draxin蛋白在成年期小鼠損傷的脊髓中被誘導(dǎo)增多，且表達集中于損傷切口周邊，并且在損傷后1-5天的不同時間內(nèi)，呈現(xiàn)損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后5天表達量逐漸增多趨勢。 4DCC為draxin的受體之一，在成年期小鼠損傷脊髓中表達增多，且集中表達于損傷切口周邊，與draxin蛋白表達位置一致。
[Abstract]:Objective:
A semi transection model of the dorsal spinal cord was successfully established to observe the changes in the expression of axon growth guiding factor draxin in different periods of spinal cord injury and its expression in the injured spinal cord, providing an experimental basis for its application in the clinical spinal cord injury.
Method錛

本文編號：2016864