本文選題：PARP-1 + 急性髓系白血病��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是起源于造血干/祖細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病,髓系造血細胞表現(xiàn)出增強的自我更新能力,同時因為細胞分化和凋亡受到阻礙,造成幼稚細胞的集聚,所以正常的造血功能被嚴重破壞,成為進展非常迅速而且難以控制的惡性腫瘤。隨著基礎研究工作的深入開展及臨床治療手段的改進,AML的預后有了顯著改善。然而,根據(jù)統(tǒng)計的五年生存率來看,六十歲以下成年患者約為30%到40%,而六十歲以上患者的該數(shù)值尚且不到10%。目前,AML的發(fā)病機制尚不完全明確,影響其發(fā)生發(fā)展的機體內(nèi)外環(huán)境因素有待于進一步探索,治療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象的具體機制不明,以及完全緩解(complete remission, CR)后患者早期與晚期復發(fā)的原因更是研究難點。因此,針對AML發(fā)生發(fā)展、多藥耐藥及復發(fā)難治機制的研究,探索新的抗癌靶點,研發(fā)新型抗AML藥物成為血液學領(lǐng)域重要任務之一。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1]是一種存在于真核細胞內(nèi)催化聚ADP核糖化的蛋白質(zhì)修飾酶,它的基本功能是修復DNA損傷。PARP-1被認為是探測DNA損傷的感受器,在DNA斷裂時它會被迅速激活,通過自身不同的結(jié)構(gòu)域識別并且結(jié)合到損傷處,催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解為尼克酰胺和ADP核糖,同時激活和催化各種受體蛋白分子的聚ADP核糖化作用,完成復雜的DNA損傷修復過程。除此之外,PARP-1能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、改變基因的甲基化以及調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)等,從而影響基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期進展及細胞增殖和死亡過程。現(xiàn)有研究表明,PARP-1在乳腺癌、肝癌及鼻咽癌等腫瘤中過表達,并且與不良預后相關(guān),但它在AML中的表達情況及對AML疾病進展的影響和具體作用機制尚不明確。本課題旨在明確AML患者骨髓標本中PARP-1的表達情況,通過小鼠體內(nèi)實驗研究其對AML疾病進展的影響,在AML細胞系Kasumi-1和1 THP-1增殖和凋亡中的作用,以及通過基因芯片篩選并證實PARP-1影響的具體分子通路。本課題研究內(nèi)容為AML的基礎研究提供新的思路,給臨床診療工作提供更多可參考利用的生物學靶點。第一部分PARP-1在急性髓系白血病發(fā)生發(fā)展中的作用研究目的：研究PARP-1分子在成人AML患者及正常對照者的骨髓標本中的表達水平,分析其與臨床預后的關(guān)系；通過構(gòu)建AML模型小鼠,闡明PARP-1分子對AML疾病進展的影響。初步明確PARP-1分子在AML中的作用,并為后續(xù)深入探討PARP-1在AM L中的分子機制打下基礎。研究方法：1.標本收集：收集成人AML患者及健康對照者的骨髓標本并分離出骨髓單個核細胞凍存。2.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(real-time RT-PCR)法檢測PARP-1的表達水平：采用TRIzol法提取骨髓單個核細胞總RNA,應用PrimeScript RT reagent試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, SYBR Green法檢測AML患者及健康對照者的骨髓單個核細胞中PARP-1表達情況,分析其與臨床療效的關(guān)系。3.AML模型小鼠的構(gòu)建：從ATCC購買小鼠AML細胞系C1498,體外培養(yǎng)擴增,然后尾靜脈注射至C57BL/6、鼠體內(nèi)。通過外周血涂片、骨髓涂片及組織切片染色鑒定模型。4.體內(nèi)研究PARP-1對AML小鼠疾病進展的作用。4.1病毒包裝及細胞感染：包裝攜帶綠色熒光蛋白(GFP)表達載體的慢病毒,感染C1498細胞系,72小時后用熒光顯微鏡初步觀測感染效率。應用嘌呤霉素(puromycin)篩選獲得穩(wěn)定表達GFP的細胞(C1498-GFP),大量擴增培養(yǎng),流式細胞術(shù)檢測篩選效率。得到穩(wěn)定的C1498-GFP細胞。4.2動物模型的構(gòu)建及實驗分組處理：6到8周齡雄性C57BL/6小鼠正常飲食飼養(yǎng),將C1498-GFP細胞尾靜脈注射到小鼠體內(nèi),構(gòu)建AML動物模型。實驗動物分為兩組：對照組,腹腔注射生理鹽水；實驗組,腹腔注射PARP-1抑制劑PJ34。4.3小鼠一般狀況觀測記錄：觀察記錄模型小鼠的精神狀態(tài),還有毛發(fā)是否粗糙和活動情況等,每五天稱量一次體重。4.4小鼠體內(nèi)AML細胞浸潤情況檢測：(1)麻醉處死小鼠后,解剖觀察小鼠臟器腫大情況。(2)流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血及肝臟組織中白血病細胞的浸潤情況。(3)組織切片H＆E染色,檢測白血病細胞浸潤情況。4.5生存曲線：記錄小鼠生存時間,繪制生存曲線,分析PARP-1功能抑制對AML疾病進展的影響。研究結(jié)果：1. Real-time RT-PC R結(jié)果顯示,PARP-1在AML患者骨髓標本中的表達水平顯著高于健康對照者,不同分型之間沒有顯著統(tǒng)計學差異。PARP-1表達水平較高的患者治療效果差。2.C1498細胞尾靜脈注射C57BL/6小鼠成功構(gòu)建小鼠AML模型。發(fā)病小鼠消瘦明顯,毛發(fā)粗糙,活動減少,體重減輕；一部分模型小鼠外周血白細胞顯著增高,另一部分明顯降低,血小板均減少,血涂片及骨髓涂片可見腫瘤細胞浸潤；肝臟腫大明顯,部分臟器腫瘤浸潤形成腫塊；組織切片HE染色可見肝、脾及腎臟內(nèi)大量的腫瘤細胞；未經(jīng)干預的模型小鼠于一月之內(nèi)因疾病進展而死亡。3.抑制PARP-1的作用能夠顯著緩解AML小鼠疾病進展。3.1與對照組小鼠相比,實驗組小鼠消瘦減輕,毛發(fā)粗糙不明顯,活動較正常,體重減輕情況也明顯改善。3.2實驗組小鼠肝脾腫大程度較對照組減輕。3.3流式細胞術(shù)證實外周血及肝臟中C1498-GFP細胞的含量在實驗組中均明顯降低。3.4組織切片HE染色結(jié)果顯示,實驗組小鼠的肝臟中C1498-GFP細胞浸潤程度減輕。3.5實驗組小鼠中位生存時間較對照組延長,兩者分別為37.5天和23.5天。結(jié)論：1. PARP-1分子在AML患者骨髓標本中高表達,相對表達水平較高的患者治療效果差,提示PARP-1可能參與AML的發(fā)生發(fā)展過程,并且在預后指導方面具有一定意義。2.通過動物模型初步證實,抑制PARP-1的活性,明顯減輕腫瘤細胞的體內(nèi)浸潤程度,延緩AML的疾病進展過程,改善預后,因此干預PARP-1的活性有可能成為AML靶向治療策略之一。第二部分PARP-1對AML細胞生物學行為的影響及作用機制研究研究目的：研究PARP-1印制對AML細胞系生物學行為及相關(guān)分子通路的影響；篩選并驗證PARP-1抑制導致顯著上調(diào)或下調(diào)表達的分子,分析PARP-1調(diào)節(jié)顯著的基因功能和分子通路；明確下游分子在AML患者骨髓標本中的表達,與臨床預后的關(guān)系,及對AML細胞存活及下游分子通路的影響；進一步分析驗證PARP-1與下游分子的相互影響。深入探討PARP-1參與AML發(fā)生發(fā)展的具體分子機制,為AML靶向治療提供新的理論基礎。研究方法：1. PARP-1抑制對AML細胞系Kasumi-1和THP-1細胞活力、周期、凋亡及相關(guān)分子通路的影響。1.1 CCK8法檢測細胞活力：配制不同濃度梯度的PJ34溶液,分別加入Kasumi-1和THP-1細胞培養(yǎng)基中,孵育48小時,CCK8法檢測并計算細胞存活率及IC50值；用分別攜帶PARP-1干擾序列及對照序列的慢病毒感染兩種AML細胞系,驗證干擾效率后進行常規(guī)培養(yǎng),CCK8法檢測24h、48h及72h的細胞活力,對比生長曲線。1.2流式細胞術(shù)檢測細胞周期：收集PJ34處理48h后的兩種細胞,碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色,利用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。1.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：PJ34處理細胞48h, Annexin V FITC/PI雙染細胞,應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。1.4 Western blot檢測周期蛋白、凋亡分子及下游通路分子的表達情況：收集處理后的細胞,提取細胞總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,SDS-PAGE膠進行凝膠電泳,western blot方法檢測PARP-1抑制對細胞周期蛋白cyclinB1、CDK1、P27和細胞凋亡相關(guān)分子Bcl-2、Bcl-xL以及AKT、ERK1/2通路的影響。2.篩選PARP-1下游分子及通路：應用表達譜芯片技術(shù)篩選PARP-1抑制后顯著差異表達的分子,并初步驗證芯片結(jié)果。利用GO富集分析法和KEGG通路分析法分析受PARP-1影響顯著的基因功能和分子通路。3.研究PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。3.1 Real-time RT-PCR法：檢測上述收集的AML患者及健康對照者的骨髓標本中MPL的表達水平,并分析其與臨床療效的關(guān)系。3.2病毒感染：構(gòu)建MPL過表達及干擾病毒,分別感染Kasumi-1和THP-1細胞,western blot驗證過表達及干擾效率。3.3 CCK8實驗：正常培養(yǎng)過表達及干擾MPL分子的兩種AML細胞,CCK8法檢測細胞24h、48h及72h的細胞活力,繪制生長曲線。3.4 Western blot實驗：檢測干擾MPL分子對AML細胞內(nèi)AKT、ERK1/2、JNK及P38MAPK通路的影響。4.進一步分析驗證PARP-1與MPL的相互影響。4.1Real-time RT-PCR及western blot法驗證PARP-1對MPL的調(diào)節(jié)作用：抑制或干擾PARP-1后,檢測MPL的mRNA及蛋白表達水平的變化。4.2CCK8法及流式細胞術(shù)檢測干預MPL對PARP-1作用的影響：用MPL的活化配體促血小板生成素(thrombopoietin, TPO)刺激AML細胞或者用慢病毒感染AML細胞過表達MPL后,再檢測PARP-1抑制對細胞的存活及凋亡的影響,分析MPL對PARP-1作用的影響。研究結(jié)果：1.PARP-1對AML細胞活力、周期、凋亡及相關(guān)分子通路的影響。1.1 PARP-1干擾抑制AML細胞活力：不同濃度梯度5、10、20、30和40μM的PJ34均能顯著抑制Kasumi-1和THP-1細胞的增殖,導致部分細胞死亡,且具有劑量依賴性。PJ34對兩種細胞的IC50值分別為23.5±3.9gM和35.6±5.5μM。利用慢病毒干擾PARP-1的表達,也顯著抑制Kasumi-1和THP-1細胞的生長。1.2抑制PARP-1使細胞停滯在G2/M期：流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,PJ34處理細胞后,處于G0/G1和S期的細胞減少,而處于G2/M期的細胞顯著增多。Westernblot檢測周期蛋白顯示,PARP-1抑制下調(diào)cyclin B1和CDK1的表達水平,上調(diào)P27蛋白表達,從而使更多的細胞進入G2/M期。1.3干擾PARP-1的作用增加AML細胞凋亡：PJ34處理細胞后,細胞凋亡率顯著增加,且PJ34濃度越高凋亡細胞越多。Western blot檢測顯示,PJ34導致抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL表達水平明顯降低。1.4抑制PARP-1降低AKT1口ERK1/2通路的活化水平：在兩種AML細胞中加入PJ34后,p-AKT/t-AKT和p-ERK/t-ERK的水平均明顯降低。2.表達譜芯片結(jié)果及分析：篩選出PARP-1抑制后顯著上調(diào)(2倍)表達的分子18個,和顯著下調(diào)(≤0.5倍)表達的分子9個。初步選取AML相關(guān)分子進行real-time RT-PCR實驗,驗證芯片結(jié)果可靠。GO富集分析提示PARP-1顯著影響細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、細胞分化、黏附作用、細胞遷移、血管生成、免疫應答及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等多種生理病理過程。KEGG通路分析提示PARP-1參與TCR信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路以及JAK/STAT信號通路等多種通路的調(diào)節(jié)。3. PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。3.1 MPL在AML患者中高表達,相對表達水平較高的患者治療效果差。3.2 MPL促進AML細胞增殖：慢病毒過表達和干擾兩種AML細胞中MPL的表達,蛋白水平證實了慢病毒過表達及干擾效率。培養(yǎng)感染后的細胞,CCK8實驗檢測顯示MPL過表達組細胞增殖明顯高于對照組,而MPL干擾組的增殖顯著低于對照干擾組。3.3 MPL影響AKT和ERK1/2通路：干擾MPL表達后,細胞中p-AKT/t-AKT和 p-ERK/t-ERK水平降低,而p-JNK/t-JNK和 p-P38/t-P38水平?jīng)]有明顯改變,說明MPL干擾后抑制了AKT及ERKl/2通路的活化,而對JNK及P38通路無顯著影響。4.驗證PARP-1與下游分子MPL的相互影響。4.1 PARP-1抑制及干擾均能顯著下調(diào)MPL的表達。4.2活化MPL信號能部分逆轉(zhuǎn)PARP-1抑制在AML細胞中的作用：TPO處理細胞后,PJ34對AML細胞存活的抑制作用明顯減弱；過表達MPL后,PJ34對AML細胞存活的抑制效應減弱,促進AML細胞凋亡的作用也減弱。結(jié)論：1.干擾PARP-1的作用能夠抑制AML細胞的增殖活力、阻礙細胞周期進展、誘導細胞凋亡,與抑制AKT和ERK1/2通路的活化有關(guān)。2. PARP-1的下游分子MPL在AML患者中高表達,與不良預后相關(guān)；MPL能夠促進AML細胞增殖,激活AKT和ERK1/2信號通路。3. PARP-1能影響MPL的表達,且干預MPL能部分逆轉(zhuǎn)PARP-1抑制的作用。4、PARP-1及下游分子信號通路的活化在AML發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,抑制其過表達及活化可能成為AML的靶向治療的新途徑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71

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本文編號：1890737