本文選題：低能量體外沖擊波 + 脂肪干細(xì)胞�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景糖尿病是人類常見的慢性疾病,會(huì)引起神經(jīng)、血管的病變,導(dǎo)致一系列的并發(fā)癥,主要有高血壓和心臟病變,晚期可并發(fā)視網(wǎng)膜病變、末梢血管病變、外周神經(jīng)病變甚至內(nèi)臟器官的損害(比如糖尿病腎病)等。而在泌尿系統(tǒng)的其他并發(fā)癥中,膀胱功能障礙(diabetic bladder dysfunction, DBD)作為一種常見并發(fā)癥,大約在所有糖尿病患者中占80%左右。DBD主要表現(xiàn)為儲(chǔ)尿期和排尿期癥狀,并不會(huì)對(duì)患者的生命有威脅,但對(duì)患者的生活質(zhì)量影響甚巨。目前,針對(duì)DBD的治療方法主要是以緩解其癥狀為主,并不能對(duì)其進(jìn)行有效的治療,所謂治標(biāo)不治本。近些年來(lái),各研究人員都在竭力尋找治療DBD的有效方法,在這個(gè)時(shí)候,脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(adipose tissue derived stem cells, ADSCs)的移植治療進(jìn)入了人們的視野。ADSCs是類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)的一種干細(xì)胞,同樣具有潛能可多向分化為脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等,同時(shí),由于脂肪在體內(nèi)含量豐富且極易獲取,因此,獲取脂肪提取ADSCs進(jìn)行研究,已經(jīng)是組織修復(fù)醫(yī)學(xué)中的一個(gè)熱點(diǎn)研究方向。在既往的研究中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ADSCs對(duì)受損的大鼠盆腔神經(jīng)節(jié)有很好的修復(fù)作用,而且可以應(yīng)用于勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)的治療中,它能夠促進(jìn)受損海綿體神經(jīng)的修復(fù)。對(duì)于ADSCs發(fā)揮作用的機(jī)制,目前的研究仍尚未得出明確的結(jié)論,近期的研究認(rèn)為ADSCs的旁分泌功能可能是其發(fā)揮作用的重要途徑。在上個(gè)世紀(jì)90年代起,體外沖擊波治療(shock wave therapy, SWT)就已經(jīng)被應(yīng)用于泌尿系結(jié)石的治療。而隨著科技及社會(huì)的進(jìn)步,SWT的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,非聚焦低能量體外沖擊波(defocused low-energy shock wave, DLSW)在組織修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用亦被越來(lái)越多的研究人員關(guān)注,而既往有研究報(bào)道了DLSW對(duì)糖尿病相關(guān)并發(fā)癥(糖尿病潰瘍或軟組織損傷等)的治療效應(yīng)。關(guān)于DLSW發(fā)揮治療效應(yīng)過(guò)程中存在的機(jī)制,已有的研究都無(wú)法很好地進(jìn)行解釋。在關(guān)于其治療機(jī)制的學(xué)說(shuō)中,我們?cè)絹?lái)越傾向于DLSW對(duì)干細(xì)胞的募集和促進(jìn)作用,這個(gè)學(xué)說(shuō)是假設(shè)DLSW可以激活干細(xì)胞、促進(jìn)干細(xì)胞向受損部位募集、增強(qiáng)干細(xì)胞發(fā)揮的作用,但其中涉及的機(jī)制也仍不清楚。因此,為了更好的探討DBD的有效治療方法,本研究將ADSCs和.DLSW同時(shí)應(yīng)用于治療DBD大鼠,來(lái)探討其治療效應(yīng)及可能存在的治療機(jī)制。目的探討DLSW對(duì)ADSCs的影響和作用,以及其作用過(guò)程中可能存在的機(jī)制；同時(shí),將DLSW和ADSCs用于治療DBD大鼠的效果,在治療過(guò)程中DLSW對(duì)ADSCs的促進(jìn)作用。材料和方法1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1) ADSCs的分離培養(yǎng)：提取雌性SD大鼠腹部性腺周圍的脂肪,應(yīng)用3%戊巴比妥對(duì)大鼠進(jìn)行全身麻醉,常規(guī)給大鼠備皮后,碘伏消毒、鋪洞巾,取大鼠下腹正中切口,取其性腺周圍的脂肪2-3m1放入冰的PBS中,縫合大鼠腹部切口。采用膠原酶I進(jìn)行消化脂肪,分離出ADSCs,置于細(xì)胞專用培養(yǎng)基中,在設(shè)定為37℃、5%CO2條件的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。2天后,去除仍未貼壁的細(xì)胞,并更換細(xì)胞培養(yǎng)基,而后每3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基一次,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋住培養(yǎng)瓶90%以上的空間時(shí),予以傳代。(2) DLSW治療：每次細(xì)胞傳代前,將培養(yǎng)的ADSCs置于SWT機(jī)器下,進(jìn)行DLSW治療,記為治療組ADSCs,同時(shí),將未進(jìn)行DLSW治療的細(xì)胞記為對(duì)照組ADSCS。于裝有貼壁ADSC的培養(yǎng)瓶表面涂抹超聲凝膠,將之置于沖擊波治療探針下方并與之接觸,用EFD為0.1mJ/mm2能量的DLSW以120次／分鐘的頻率對(duì)ADSCs進(jìn)行治療。DLSW治療后24小時(shí),無(wú)菌條件下進(jìn)行細(xì)胞傳代。治療組ADSCs一共接受DLSW治療5次。(3)兩組細(xì)胞在每次傳代后均進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的檢測(cè)對(duì)比,并用鬼筆環(huán)肽進(jìn)行細(xì)胞骨架染色,以進(jìn)一步比較兩組細(xì)胞的差異。(4) ELISA檢測(cè)：每次體外沖擊波治療完成后,將治療組ADSC和對(duì)照組ADSC的培養(yǎng)基均更換為3ml不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。24小時(shí)后,將培養(yǎng)基收集至EP管中,1200rpm離心10分鐘后,置入-80℃冰箱中保存,以待不同代的培養(yǎng)基收集齊全后同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。為消除偏差,兩組細(xì)胞的培養(yǎng)基應(yīng)同時(shí)收集、儲(chǔ)存并同時(shí)檢測(cè)。利用ELISA試劑盒檢測(cè)治療組和對(duì)照組的大鼠ADSC培養(yǎng)基(P1～P5)中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)和CXC配體5(CXC ligand 5, CXCL5)的水平。兩組細(xì)胞均采用第4代細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：選擇P4的治療組ADSC和對(duì)照組ADSC同時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),以觀察其細(xì)胞表面抗原的變化。檢測(cè)細(xì)胞表面抗原包括CD34、Stro-1、 OCT、CD106、CD29和CD49d。(6)細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：為了檢測(cè)細(xì)胞的增殖功能,將P4期的ADSCs應(yīng)用EdU進(jìn)行標(biāo)記過(guò)夜,然后采用EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用EdU標(biāo)記細(xì)胞法來(lái)檢測(cè)DLSW對(duì)ADSCs增殖能力的促進(jìn)作用。同時(shí),應(yīng)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖指標(biāo)——增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和Ki67蛋白的表達(dá)水平。(7)細(xì)胞遷移能力檢測(cè)：檢測(cè)兩組細(xì)胞CXCR2的表達(dá)水平及細(xì)胞遷移能力。為了檢測(cè)細(xì)胞的遷移功能,首先檢測(cè)P4期的治療組和對(duì)照組的細(xì)胞中CXCR2蛋白的變化。采用免疫熒光染色和Western blot兩種方法來(lái)檢測(cè)CXCR2的表達(dá)水平。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,采用趨化因子CXCL5作為誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行遷移。(8)應(yīng)用Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞傳導(dǎo)通路的變化,包括MAPK信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路、PI-3K/AKT信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路的變化。另一方面,采用相應(yīng)的信號(hào)通路阻斷劑進(jìn)行干預(yù)后,再檢測(cè)兩組細(xì)胞的分泌功能和增殖功能的變化。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。隨機(jī)選擇10只大鼠,拿來(lái)當(dāng)做正常對(duì)照組(N組),喂養(yǎng)普通食物；另外選取30只作為糖尿病組,首先給予高脂肪飲食(high fat diet, HFD)喂養(yǎng)30天,然后分2次按30mg/kg經(jīng)大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),間隔時(shí)間為1周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程,兩組大鼠的喂養(yǎng)食物不變。糖尿病大鼠需要定時(shí)記錄其空腹血糖,當(dāng)大鼠的空腹血糖≥7.8mmol/L后,且多次測(cè)量均維持在此水平,才能繼續(xù)進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。注射STZ后3個(gè)月,在30只糖尿病大鼠中,隨機(jī)選取20只大鼠經(jīng)腹腔獲取脂肪,用來(lái)提取、培養(yǎng)ADSCS。為了進(jìn)行ADSCs的體內(nèi)追蹤,應(yīng)采用10μM的EdU對(duì)ADSCs進(jìn)行過(guò)夜標(biāo)記,然后計(jì)數(shù)出3×106個(gè)細(xì)胞,用0.5ml的PBS稀釋后,經(jīng)尾靜脈注射回大鼠體內(nèi)。隨機(jī)將這30只糖尿病大鼠分成3組：第1組,經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.5ml的PBS,不做其他處理(糖尿病對(duì)照組,DM組,n=10)；第2組,經(jīng)大鼠尾靜脈向大鼠體內(nèi)注射0.5ml PBS稀釋的3×106個(gè)自體ADSCs,不做其他處理(ADSC組,n1=10)；第3組,經(jīng)大鼠尾靜脈向大鼠體內(nèi)注射0.5ml PBS稀釋的3×106個(gè)自體ADSCs后,第2天即予以DLSW沖擊大鼠腹部(ADSC+SW組,,1=10)。此外,正常對(duì)照組(N組)的大鼠也應(yīng)該在同時(shí)經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.5ml的PBS。(2)清醒狀態(tài)下測(cè)定大鼠的膀胱內(nèi)壓。進(jìn)行膀胱內(nèi)壓測(cè)定前24小時(shí),分別向膀胱內(nèi)和腹腔中各留置一根聚乙烯-90導(dǎo)管(導(dǎo)管一端連接乳膠球囊)用來(lái)測(cè)量膀胱內(nèi)壓和腹腔壓力。為了排除大鼠自身膀胱活動(dòng)的影響,在正式記錄壓力數(shù)據(jù)前,應(yīng)該讓大鼠先適應(yīng)一段時(shí)間再正式測(cè)定,測(cè)量膀胱內(nèi)壓時(shí)需要持續(xù)1小時(shí),記錄測(cè)定的數(shù)值進(jìn)行后續(xù)分析。(3)膀胱組織中EdU標(biāo)記的ADSCs的定量和細(xì)胞凋亡的定量。為檢測(cè)ADSCs募集至膀胱損傷組織中的情況,我們用EdU標(biāo)記的ADSCs在評(píng)估組織中的定量(即高倍鏡視野中EdU陽(yáng)性ADSCs的數(shù)目)來(lái)表示,我們先在熒光顯微鏡的高倍鏡視野中觀察EdU陽(yáng)性ADSCs并采集圖像,然后借助Image-Pro Plus軟件來(lái)計(jì)算EdU陽(yáng)性的ADSCs數(shù)目。為檢測(cè)經(jīng)DLSW治療后膀胱組織切片中細(xì)胞凋亡的情況,我們采用TUNEL試劑盒染色來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡,然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,并借助Image-Pro Plus軟件分析凋亡細(xì)胞的數(shù)目。(4)免疫熒光染色和免疫組織染色。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析收集各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),使用SPSS 19.0軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用單因素方差分析來(lái)分析各組之間的連續(xù)型數(shù)據(jù)的比較,而各組大鼠的膀胱功能改善情況則利用Fisher卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。本研究中的所有數(shù)據(jù)均采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)來(lái)表示。只有當(dāng)P0.05時(shí),才代表兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)經(jīng)DLSW治療的ADSCs與未經(jīng)治療的ADSCs的形態(tài)并無(wú)明顯差別,細(xì)胞骨架染色亦未見明顯變化,說(shuō)明DLSW并無(wú)破壞ADSCs的形態(tài)特征。(2)流式細(xì)胞檢測(cè)中,經(jīng)DLSW治療的ADSCs與未經(jīng)治療的ADSCs表達(dá)CD34、 Stro-1、OCT4、 CD106、CD29和CD49d的水平均未見明顯差異,表明DLSW并未改變ADSCs的細(xì)胞表型。(3) DLSW可增強(qiáng)ADSCs的分泌功能。分泌功能實(shí)驗(yàn)中,可見與未經(jīng)治療的ADSCs組對(duì)比,經(jīng)DLSW治療的ADSCs組中VEGF、NGF和CXCL5的分泌濃度均顯著增加。(4) DLSW可促進(jìn)ADSCs的增殖功能。在Western blot檢測(cè)中,經(jīng)DLSW治療的ADSCs表達(dá)PCNA和Ki67的水平均比未經(jīng)治療的ADSCs明顯升高。而在EdU試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,可見在經(jīng)DLSW治療的ADSCs組中,EdU標(biāo)記的ADSCs數(shù)較未經(jīng)治療的ADSCs明顯增多。(5) DLSW不僅可以促進(jìn)ADSCs的體外遷移,并且可以增強(qiáng)ADSCs在體內(nèi)的遷移能力。在體外遷移實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)DLSW治療的ADSCs組中遷移至下室的細(xì)胞明顯比未經(jīng)治療的ADSCs組多。(6) DLSW是通過(guò)MAPK信號(hào)通路、PI-3K/AKT信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路來(lái)激活A(yù)DSCs的,通過(guò)阻斷實(shí)驗(yàn),可以看出,阻斷通路后,ADSCs的分泌能力和增殖能力明顯減弱。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)測(cè)定膀胱內(nèi)壓實(shí)驗(yàn)中,注射經(jīng)DLSW治療的ADSCs的大鼠中,有70%大鼠的膀胱功能恢復(fù)至正常水平,其余的亦有不同程度的好轉(zhuǎn),而在對(duì)照組中,僅有40%大鼠的膀胱功能恢復(fù)至正常水平。說(shuō)明DLSW亦可輔助ADSCs促進(jìn)膀胱功能的恢復(fù)。(2)大鼠膀胱組織中EdU標(biāo)記細(xì)胞的定量。注射ADSCs后1個(gè)月,切取膀胱組織行EdU染色,檢測(cè)膀胱內(nèi)EdU標(biāo)記的ADSCs的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn),EdU陽(yáng)性的細(xì)胞在膀胱粘膜下層和肌層中均能觀察到(圖9A)。在ADSC+SW組大鼠的膀胱組織切片中,膀胱粘膜下層中EdU陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目較ADSC組明顯增多；而在肌層中的EdU陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目,兩組并無(wú)明顯差異。(3)細(xì)胞凋亡的定量檢測(cè)。應(yīng)用TUNEL試劑盒測(cè)量細(xì)胞凋亡,只有TUNEL和DAPI同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)胞核才是凋亡細(xì)胞核。DM組大鼠中的細(xì)胞凋亡數(shù)目較N組明顯增多(P0.05)。而在ADSC組和ADSC+SW組大鼠的膀胱組織切片中,膀胱粘膜層的凋亡細(xì)胞較DM組明顯減少(P0.05)。(4)血管的定量檢測(cè)。在N組大鼠中,膀胱粘膜下層可見豐富的eNOS陽(yáng)性的血管、連續(xù)致密的Col IV表達(dá)陽(yáng)性的毛細(xì)血管網(wǎng)。而在DM組大鼠的膀胱粘膜下,上述血管的密度減少,毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)不再連續(xù)、陽(yáng)性表達(dá)量下降。在ADSC組和ADSC+SW組中,血管的分布以及毛細(xì)血管網(wǎng)的連續(xù)性和厚度較DM組均有明顯改善,而且,ADSC+SW組的改善效果更佳。結(jié)論DLSW通過(guò)MAPK信號(hào)通路、PI-3K/AKT信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路來(lái)激活A(yù)DSCs,以促進(jìn)ADSCs的分泌、增殖和遷移功能,且并不會(huì)改變ADSCs的形態(tài)以及表型。此外,DLSW可以通過(guò)激活A(yù)DSCs的作用來(lái)發(fā)揮作用,改善DBD大鼠的膀胱功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 雙衛(wèi)兵;王東文;;糖尿病膀胱研究進(jìn)展[J];中華泌尿外科雜志;2006年03期

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本文編號(hào)：1788270