本文選題：骨肉瘤　切入點：SPON1蛋白　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：骨肉瘤(Osteosarcoma)也稱為成骨肉瘤,是發(fā)生于兒童和未成年人的常見惡性腫瘤,約占骨原發(fā)性腫瘤的20%。骨肉瘤組織學特點是間充質(zhì)干細胞或成骨細胞分化障礙,能夠直接生成骨或者骨樣組織,侵襲性強并且早期就易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。骨肉瘤的組織學分型為(傳統(tǒng)型,毛細血管擴張型,骨旁骨肉瘤,骨膜骨肉瘤,低級中央,小細胞型)。最常見的為傳統(tǒng)型,按照細胞組織形態(tài)又分為:骨母細胞型、軟骨母細胞型、纖維母細胞型,此三型在臨床轉(zhuǎn)歸上沒有明顯差異。由于其惡性程度高、侵襲性和轉(zhuǎn)移性強,發(fā)病早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移,易轉(zhuǎn)移到肺和骨,確診的患者5年生存率只有60%,10年生存率不超過30%。約15-25%的患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,導致化療失敗和不良預后。此外,近90%骨肉瘤患者有轉(zhuǎn)移或復發(fā),甚至是徹底的外科手術切除原發(fā)腫瘤后。尤其在發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中,5年生存率至今不足30%。大多數(shù)原發(fā)性骨肉瘤的病因不明。細胞遺傳學研究顯示在原發(fā)性骨肉瘤患者體內(nèi)基因(包括很多染色體)發(fā)生了一系列復雜的變化,其發(fā)生和發(fā)展可能與這些基因的失調(diào)控有關,但是并沒有具體模式。因此,有必要找到骨肉瘤與正常組織間的差異表達基因,確定骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的分子機制,為抑制骨肉瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移探索新的治療方法。底板反應蛋白(SPON1),即F-spondin,一種分泌型細胞外基質(zhì)糖蛋白,最初是從脊椎動物的胚胎底板分離出來。研究發(fā)現(xiàn)重組SPON1蛋白能促進神經(jīng)細胞粘著和神經(jīng)元生長,說明SPON1有調(diào)節(jié)胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長的作用。SPON1還能促進血管平滑肌細胞增殖并且抑制血管生成。除此之外,還發(fā)現(xiàn)SPON1在很多其他組織中有表達,如卵巢、胚胎生長板軟骨、牙周組織、骨關節(jié)炎軟骨。但是,SPON1在骨肉瘤組織中是否有表達,表達量如何,還不清楚�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一組含有鋅離子和鈣離子依賴性內(nèi)肽蛋白水解酶,組成成員有20多個,主要作用是降解細胞外基質(zhì)的一些重要的蛋白酶類,使細胞外基質(zhì)維持動態(tài)平衡。以往的很多研究證實MMPs家族在腫瘤的增殖、血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用�；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是MMPs家族中的重要一員,主要降解細胞外基質(zhì)中的主要成分Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤增殖抗原Ki67參與多個細胞內(nèi)信號通路,是反映細胞增殖活性的敏感指標,在增殖期細胞表達,而在靜止期細胞不表達,半衰期短,在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過表達現(xiàn)象。著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是細胞質(zhì)內(nèi)的一種蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK),與細胞的粘附功能密切相關。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移時,整合素通過使異質(zhì)性黏附升高,同質(zhì)性黏附降低,促進腫瘤細胞遷移和侵襲。FAK是整合素信號通路中的關鍵分子,參與了腫瘤細胞的多個信號傳導途徑。肉瘤激酶(sarcoma,Src)家族成員是由原癌基因編碼的位于細胞質(zhì)的非受體型酪氨酸蛋白激酶,分子量為60k D,是第一個被發(fā)現(xiàn)具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌蛋白,參與細胞內(nèi)多條信號傳遞途徑。本研究的目的是確定骨肉瘤中SPON1的表達模式和分子機制。我們用人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系(KHOS、KRIB)和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系(HOS、U2OS)進行研究。并用si RNA轉(zhuǎn)染技術證明SPON1、Fak、Src信號通路的作用機制。開展臨床骨肉瘤樣本SPON1的表達的免疫組化分析,研究SPON1水平分別和MMP9和Ki67表達的關系。SPON1對細胞遷移和侵襲的影響。最后,我們的研究表明,SPON1/Fak/Src相聯(lián)通路可能是控制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的一個有效途徑。第一部分探討SPON1是否為人轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和人非轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的差異表達基因目的:1確定4種骨肉瘤細胞系KHOS、KRIB、HOS、U2OS符合人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系的劃分,以便進行下一步實驗。2確定從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出的SPON1基因是人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤與人低轉(zhuǎn)移性骨腫瘤間的一種差異基因。3探討高轉(zhuǎn)移性的人骨肉瘤標本與低轉(zhuǎn)移性的人骨軟骨瘤標本中SPON1表達是否存在差異,以及SPON1和兩種腫瘤標志物MMP9、Ki67間的關系。方法:1 GEO數(shù)據(jù)庫高頻率突變基因附近核苷酸序列進行GC%含量分析,同時選取高突變基因正常位點作為參照,尋找差異表達基因,并進行分析。2根據(jù)文獻選擇4種細胞系作為實驗對象,其中KHOS和KRIB為人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系,HOS和U2OS為人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系,并用細胞遷移及侵襲實驗驗證。3用蛋白免疫印記實驗(Westernblot)檢測4種人骨腫瘤細胞系(人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HOS和U2OS;人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系KHOS和KRIB)中SPON1蛋白表達及差異。4免疫組織化學法檢測72例人骨肉瘤組織芯片和24例人骨軟骨瘤組織芯片中SPON1陽性表達率有無差異,組織芯片用二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗3遍后,在含有0.01M檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液中微波加熱15分鐘,進行抗原修復。PBS沖洗后,組織切片用0.3%過氧化物酶滅活溶液封住內(nèi)源性過氧化物酶(封酶),然后分別用SPON1一抗,MMP9一抗和Ki67一抗孵育,4°C過夜。PBS洗3遍,切片用辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗中溫育,加3,3’-二氨基聯(lián)苯胺磷酸鹽顯色。蘇木精復染。染色陽性的腫瘤細胞百分比來計算總的免疫染色評分。陽性百分比的分數(shù)如下:0-10%為0分;10%-30%為1分;30%-60%為2分;超過60%為3分。0-1分定義為低表達,2-3分定義為高表達。結果:1 GEO數(shù)據(jù)庫(GSE49003)中高頻率突變基因附近核苷酸序列進行GC%含量分析,同時選取高突變基因正常位點作為參照,得出SPON1可能為人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和人低轉(zhuǎn)移性骨腫瘤間的差異基因。2細胞遷移及侵襲實驗結果顯示,根據(jù)文獻選出的4種人骨肉瘤細胞系,其中KHOS和KRIB為人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系,HOS和U2OS為人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系,可以作為研究人骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移的實驗細胞系。3通過蛋白免疫印跡實驗在4種人骨肉瘤細胞系中均檢測到SPON1蛋白。但是和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HOS和U2OS相比,在KHOS和KRIB兩種人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系中SPON1蛋白高表達。4免疫組織化學顯示,在轉(zhuǎn)移率高的人骨肉瘤標本中SPON1蛋白陽性表達率明顯高于轉(zhuǎn)移性低的人骨軟骨瘤標本,表明SPON1和腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關。另外,用斯皮爾曼等級相關系數(shù)統(tǒng)計分析得出,在人骨肉瘤標本中SPON1和MMP9間有顯著正相關(P0.001,R=0.745),而不是Ki67(P=0.359)。第二部分探討SPON1在骨肉瘤細胞和體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用目的:1研究SPON1蛋白在骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用。2在裸鼠動物模型上觀察異種移植腫瘤生長情況及SPON1在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。方法:1 si RNA轉(zhuǎn)染,生長曲線及MTT方法測定細胞生長及增殖情況:1.1根據(jù)si RNA設計原則,體外構建并合成2種沉默SPON1基因表達的si RNA-SPON1(si-SPON1-1、si-SPON1-2)和1種陰性對照si RNA(si-Ctrl)。通過脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系KHOS和KRIB,沉默細胞中SPON1基因;1.2 Westernblot實驗檢驗干擾效率;1.3生長曲線及MTT實驗檢測si RNA脂質(zhì)體載體特異性沉默SPON1基因?qū)HOS和KRIB細胞的生長和增殖情況有無影響;1.4 Transwell細胞遷移和侵襲實驗檢測SPON1沉默后的人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系KHOS與KRIB細胞遷移與侵襲能力的變化。2用人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HOS和U2OS:2.1將人重組SPON1蛋白稀釋為5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、50nmol/l,Westernblot實驗鑒定。2.2 MTT法測定不同濃度(0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L)人重組SPON1蛋白對兩種細胞系的生長和增殖情況有無影響;2.3 Transwell細胞遷移和侵襲實驗檢測不同濃度(0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L)人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人骨肉瘤細胞系HOS與U2OS后,對兩種細胞的遷移與侵襲能力的影響。3裸鼠體內(nèi)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移實驗:收集si RNA-SPON1-1轉(zhuǎn)染的KHOS細胞和陰性對照si-Ctrl轉(zhuǎn)染的KHOS細胞,制備細胞-基質(zhì)膠混合物,注入麻醉裸鼠的脛骨近端(n=5只/組)。接種后6周,收集原位腫瘤和鼠肺。稱重原位腫瘤,并在解剖立體顯微鏡下查數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤結節(jié)的個數(shù)。最后,原位腫瘤及肺部轉(zhuǎn)移瘤用10%中性緩沖福爾馬林固定,石蠟包埋,5μm厚切片,HE染色。觀察異種移植腫瘤生長情況及SPON1在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。結果:1 Westernblot實驗結果顯示:兩種SPON1 si RNA(si-SPON1-1,si-SPON1-2)轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系KHOS和KRIB,特異性沉默了SPON1基因的表達,兩種細胞的SPON1蛋白表達明顯下降。2生長曲線實驗MTT實驗均表明si RNA脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)染特異性沉默SPON1基因?qū)HOS和KRIB細胞的生長和增殖情況無明顯影響(P0.05);不同濃度人重組SPON1蛋白培養(yǎng)對人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HOS和U2OS的生長和增殖情況無明顯影響(P0.05)。3與對照細胞比較,沉默SPON1基因降低人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系KHOS和KRIB細胞分解細胞基質(zhì)并侵襲到下層小室的能力,遷移及侵襲到下層小室的細胞明顯減少。重組人SPON1蛋白促進人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HOS和U2OS細胞遷移和侵襲,并呈劑量依賴關系。4將沉默SPON1基因的KHOS細胞和未沉默SPON1基因的KHOS細胞接種于麻醉裸鼠的脛骨近端,接種后6周,收集原位腫瘤和鼠肺。病理切片確認原位腫瘤為骨肉瘤,鼠肺腫瘤為骨肉瘤轉(zhuǎn)移瘤。結果顯示,在KHOS細胞中特異性沉默SPON1基因不影響異種移植腫瘤生長,但是對照組(未沉默SPON1基因的KHOS細胞接種)鼠的肺轉(zhuǎn)移病灶均明顯多于SPON1敲除組。第三部分探討骨肉瘤細胞中SPON1與FAK\Src信號通路關系目的:研究SPON1促進骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移是否與FAK\Src信號通路有關方法:1蛋白免疫印跡實驗(Westernblot)檢測特異性沉默SPON1基因的人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系KHOS細胞中FAK、Src的磷酸化水平,再檢測用不同濃度人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HOS細胞中的FAK、Src的磷酸化水平。2為了進一步證明FAK和Src在SPON1引起的轉(zhuǎn)移過程中的作用,用si RNA分別沉默兩種人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HKOS和KRIB細胞中FAK基因和Src基因后,對兩種細胞進行細胞遷移和侵襲實驗。用人重組SPON1蛋白培養(yǎng)已經(jīng)沉默F(xiàn)AK、Src基因的KHOS、KRIB細胞,觀察其遷移及侵襲能力情況。結果:1在人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤HKOS細胞,特異性沉默SPON1基因?qū)е翭AK和Src的磷酸化水平降低。用人重組SPON1培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系HOS細胞,FAK和Src的磷酸化水平升高,并呈劑量依賴性關系。說明人骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移性的高低與細胞內(nèi)SPON1、FAK、Src均有關,FAK和Src的磷酸化水平與SPON1有關。2在沉默F(xiàn)AK和Src基因的HKOS和KRIB細胞,遷移和侵襲能力明顯下降。用不同濃度人重組SPON1蛋白(0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L)培養(yǎng)已經(jīng)沉默F(xiàn)AK、Src基因的KHOS細胞,其遷移及侵襲能力無明顯改善。說明在HKOS和KRIB細胞,SPON1對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的增強作用由于沉默F(xiàn)AK和Src完全受阻。FAK/Src信號通路是SPON1增強骨肉瘤轉(zhuǎn)移過程中的眾多信號通路之一。結論:1 SPON1是人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系的差異表達基因,也是人轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和人非轉(zhuǎn)移性骨軟骨瘤間的差異表達基因,在骨肉瘤細胞遷移侵襲過程中可能具有重要的調(diào)控作用。并且發(fā)現(xiàn)SPON1水平與原發(fā)腫瘤細胞的MMP9表達密切相關。2在體內(nèi)或體外實驗中,通過沉默SPON1基因,使人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系的轉(zhuǎn)移和侵襲行為得到顯著抑制;用人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞,細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力明顯提高�；谶@一實驗結果,我們推測,SPON1可能是作為骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中的一個調(diào)節(jié)因子來發(fā)揮作用。3 SPON1蛋白可顯著提高FAK和SRc信號通路的磷酸化水平,從而促進細胞侵襲。FAK/Src信號通路是SPON1引起的骨肉瘤轉(zhuǎn)移過程中的關鍵因子。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

【參考文獻】

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本文編號：1666630