本文選題：神經干細胞　切入點：C6膠質瘤細胞　出處：《瀘州醫(yī)學院》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：探討神經干細胞與替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠生存狀況的影響。方法：實驗共分三部分。第一部分：大鼠神經干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。(1)選用孕12-14天的胎鼠，從這些胎鼠腦中分離出神經干細胞(Neuralstem cells，NSCs)，然后利用無血清培養(yǎng)的方式進行培養(yǎng)以及傳代；(2)對分離出的神經干細胞用免疫熒光進行Nestin鑒定，，然后將純化后的第3-4代神經干細胞球重懸，并進行培養(yǎng)，使得其活性呈最佳狀態(tài)，并調整細胞密度為4x106個/20ul待用。第二部分：大鼠C6腦膠質瘤模型建立。(1)取凍存的C6膠質瘤細胞進行細胞復蘇、培養(yǎng)，測定細胞存活率，取其對數(shù)期細胞，同時調整細胞密度為106個/20ul待用，并將部分未用的C6膠質瘤細胞凍存；(2)取對數(shù)期的C6膠質瘤細胞，利用腦立體定向儀向大鼠的尾狀核接種，構建C6腦膠質瘤模型大鼠90只，觀察大鼠術后的生存質量以及生存時間，并記錄，其中有8只大鼠意外死亡。第三部分:神經干細胞與替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠生存狀況影響。利用神經干細胞與替莫唑胺治療大鼠C6膠質瘤，經第二部分處理后的第7天，將剩下的82只模型大鼠隨機抽取兩只處死，剖顱取出腫瘤組織進行HE染色。剩下80只隨機分為四組：對照組（A組）、神經干細胞植入組（B組）、替莫唑胺組（C組）、替莫唑胺聯(lián)合神經干細胞組（D組）；A組：麻醉并固定，立體定位頭架引導下向瘤內注入生理鹽水20ul。 B組：麻醉固定，在立體定位頭架的引導下將總數(shù)為4x106個的20ul神經干細胞注入其瘤內。C組：利用灌胃針向大鼠灌入替莫唑胺：50mg／kg，連服5天。D組：麻醉固定，在立體定位頭架的引導下將總數(shù)為4x106個的20ul神經干細胞注入其瘤內，神經干細胞注入的第二天開始用灌胃針向大鼠灌入替莫唑胺50mg／kg，連服5天。對大鼠生存質量及生存期進行觀測、記錄，對大鼠的生存期行生存分析，并繪制圖表；模型大鼠死亡后行剖顱探查并取出腫瘤，觀察并用電子天平稱量，記錄數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學分析，并繪制圖表；稱量后將腫瘤組織進行HE染色。 結果：第一部分大鼠神經干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定：分離的胎鼠神經干細胞，大量的細胞呈單細胞懸浮生長的狀態(tài)，并形成大小不等、細胞量不同的細胞球；行免疫熒光染色Nestin呈陽性，證實了該細胞為有活性的神經干細胞。第二部分大鼠C6腦膠質瘤模型建立：(1)C6膠質瘤細胞在對數(shù)期時，細胞生長排列緊密，疏密均勻，貼壁較牢；大多數(shù)呈多角形、梭形。(2)構建90只SD雄性大鼠C6腦膠質瘤模型：術中2只大鼠死于麻醉意外，4只大鼠于手術第三天死于顱內血腫，2只大鼠于第5天不明原因死亡；剩余的82只模型大鼠進入實驗處理與分析。建模大鼠手術后第2天即自行覓食，但活動量、進食及飲水量較術前減少，皮毛不整潔，顏色欠光澤，精神萎靡；接種后第6天，攻擊行為、逃避行為均有增強。第三部分神經干細胞與替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠生存狀況影響：神經干細胞植入組（B組）、替莫唑胺組（C組）及替莫唑胺聯(lián)合神經干細胞組（D組）較對照組（A組）生存質量明顯的改善；A、B、C、D四組的平均生存期分別為：23.700天、28.600天、28.900天、29.500天。采用兩兩間的Kaplan-Meier法分析：B、C、D三組均較A組生存期延長，統(tǒng)計學有差異(p0.05)，但B、C、D三組之間生存期比較卻無統(tǒng)計學差異(p0.05)。各組大鼠死亡后剖顱觀察：均可在右側大腦半球稍前端形成橢圓形腫瘤。A、B、C、D四組腫瘤重量分別為：104.105±9.877mg，95.175±9.387mg，95.870±9.542mg，95.905±8.807mg；行組間的方差分析，F(xiàn)=4.061，P=0.010，差異有統(tǒng)計學意義，可以認為四組的重量不全相同；故采用t檢驗進行兩兩比較，經t檢驗進行兩兩比較提示：A組大鼠的腫瘤重量較B、C、D三組均較重，比較有統(tǒng)計學差異(p0.05)； B、C、D組之間兩兩比較示：腫瘤重量的比較無統(tǒng)計學差異(p0.05)。四組的膠質瘤組織HE染色切片都見腫瘤細胞生長極為活躍，并伴有一定的浸潤性；正常腦組織與腫瘤交界處能見到大量浸潤生長的腫瘤細胞，有明顯的界線，瘤體內的血管增多增粗。 結論：(1)神經干細胞能用Nestin法鑒定，鑒定后可用于有關神經干細胞的實驗研究。 (2)采用立體定向法建立大鼠C6腦膠質瘤模型可靠性、穩(wěn)定性較高，該模型是腦膠質瘤較為理想動物模型，適于腦膠質瘤的實驗研究。 (3)神經干細胞可延長腦膠質瘤大鼠的生存期，提高生存質量，減輕腫瘤重量。 (4)神經干細胞聯(lián)合替莫唑胺較單一的替莫唑胺或神經干細胞治療膠質瘤大鼠，生存期、生存質量以及腫瘤重量未見明顯改善。
[Abstract]:Objective: To investigate the effects of neural stem cells and temozolomide on rat brain glioma survival. Methods: the experiment is divided into three parts. The first part: the neural stem cells isolated from rat, cultured and identified. (1) the pregnant 12-14 day fetal rats, neural stem cells can be isolated from the fetal in rats (Neuralstem cells, NSCs), and then use the serum-free culture way were cultured and passaged; (2) on the isolated neural stem cells were identified by Nestin immunofluorescence, and then purified the 3-4 generation of neural stem cells resuspended and were cultured, the activity was the best state, and adjust the cell density of 4x106 /20ul for use. The second part is the establishment of rat C6 glioma model. (1) the cell recovery, the cryopreservation of C6 glioma cell culture, cell viability was determined from the logarithmic phase cells, and the cell density was adjusted to 106 /20ul to be 鐢

本文編號：1616978