發(fā)布時(shí)間：2018-02-28 02:30

  本文關(guān)鍵詞： 阿霉素腎病 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞移植 腎動(dòng)脈 治療　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目 的分離、培養(yǎng)和鑒定SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),觀察MSCs靜脈移植和動(dòng)脈移植的安全性以及在SD大鼠腎臟內(nèi)的分布,探討MSCs移植治療慢性阿霉素腎病的可行性,并對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行探討,為實(shí)際臨床過(guò)程中用MSCs移植的方式來(lái)治療慢性腎臟疾病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。取12周齡雄性SD大鼠股骨和脛腓骨在磷酸鹽緩沖液里面,用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液對(duì)骨髓內(nèi)腔進(jìn)行全面的沖洗,將骨髓細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行收集,在其中再加入Ficoll分離液,離心30分鐘,2000 r/min之后,將沉淀下來(lái)的骨髓細(xì)胞進(jìn)行收集,用磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)離心10分鐘,以1600 r/min之后,將上清棄掉,PBS溶細(xì)胞接種在塑料培養(yǎng)瓶中進(jìn)行接種處理,在溫度為37℃,環(huán)境為5% CO2的孵箱培養(yǎng)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面型號(hào)的抗原。誘導(dǎo)向成骨、脂肪細(xì)胞分化以觀察細(xì)胞多項(xiàng)分化潛能。當(dāng)骨髓MSCs P4至P6細(xì)胞經(jīng)過(guò)染色的標(biāo)示之后,使用0.1%的胰酶進(jìn)行消化,用含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基停止消化的過(guò)程之后進(jìn)行離心,用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基來(lái)制作懸浮細(xì)胞,并且將細(xì)胞濃度調(diào)整到2x106／ml備用。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外標(biāo)示的具體方法：取出體外培養(yǎng)P4至P6代的BMSCs生長(zhǎng),當(dāng)其生長(zhǎng)到80%融合后,放置于5%CO、2%O2、93%N2的環(huán)境中,過(guò)48小時(shí)后,造成MSCs缺氧的情況,用Ad5／F35腺病毒攜帶的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染,經(jīng)過(guò)6小時(shí)的培養(yǎng),再其中加入相等量的L-DMEN,24小時(shí)后,放置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。流式細(xì)胞儀分析MSCs表面CXCR4表達(dá)情況。2.探討不同途徑移植MSCs對(duì)阿霉素慢性腎病大鼠的影響。14周齡雄性SD大鼠72只隨機(jī)分為6組,各12只：①阿霉素模型對(duì)照組(ADR組)：通過(guò)手術(shù)的方法,將SD大鼠左側(cè)腎臟切除,之后,將4mg/kg劑量的阿霉素注射到大鼠尾靜脈中,術(shù)畢,麻醉過(guò)后待大鼠自然清醒,一周后再?gòu)奈察o脈給阿霉素1次(4mg/kg)。②假手術(shù)組(Sham組)：手術(shù)入路方式同ADR組,進(jìn)入腹腔后分離左腎但不切除左腎,逐層縫合,術(shù)畢讓大鼠自然清醒,ADR注射阿霉素時(shí)Sham組以等量生理鹽水代替。③阿霉素造模+細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植組(ADR+MSCs-V組)：末次注射阿霉素后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經(jīng)尾靜脈注射,第5周從尾靜脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。④阿霉素造模+細(xì)胞經(jīng)腎動(dòng)脈移植組(ADR+MSCs-A組)：末次注射阿霉素后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經(jīng)腎動(dòng)脈注射,第5周從腎動(dòng)脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。⑤Sham+尾靜脈注射MSCs組(Sham+MSCs-V組)：末次注射生理鹽水后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經(jīng)尾靜脈注射,第5周從尾靜脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml). ⑥Sham+1腎動(dòng)脈注射MSCs組(Sham+MSCs-A組)：末次注射生理鹽水后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經(jīng)腎動(dòng)脈注射,第5周從腎動(dòng)脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。6組大鼠分別于末次細(xì)胞移植的第0周、移植后第1周、2周各組取4只大鼠,處死前收集24小時(shí)尿量,處死后收集血標(biāo)本、腎臟、心臟、肝臟、骨髓,進(jìn)行以下檢查：①血標(biāo)本檢測(cè)血紅蛋白、腎功能(血尿素氮、血肌酐)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨基酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血清白蛋白、血清鈉；②尿標(biāo)本行24h尿蛋白定量檢測(cè)；③細(xì)胞移植后第2周,ADR組、Sham組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組大鼠腎組織均進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色、六銨銀染色(PASM)、Masson染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)方面的變化；④ADR組、Sham組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組大鼠心臟、肝臟、骨髓均做病理切片,光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。⑤免疫組化檢測(cè)ADR組、Sham組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組大鼠腎臟AQP1, AQP2的表達(dá),電鏡觀察各組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)。3.14周齡雄性SD大鼠84只,隨機(jī)分為4組：ADR組,ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組每組各24只,Sham組12只。模型制備和MSCs用量同前,使用缺氧條件下培養(yǎng)并經(jīng)EGFP轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染的MSCs。4組大鼠在MSCs移植后第1天、第7天、第14天,第30天,ADR組,ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組每組各取6只大鼠處死,Sham組取3只大鼠處死,處死后留腎臟,行以下檢測(cè)：①在激光共聚焦熒光顯微鏡下,對(duì)顯示綠色熒光的MSCs在腎臟中的分布情況進(jìn)行具體的觀察；②Real-time PCR法檢測(cè)腎臟中SDF-1mRNA表達(dá)；③移植后第14天,Western-blotting檢測(cè)腎臟中SDF-1蛋白的水平。4. 14周齡雄性SD大鼠32只,隨機(jī)分為4組：ADR組,ADR+MSCs-A組,ADR+NS-A組,Sham組,各組8只。模型制備和MSCs用法用量同前,但ADR+MSCs-A組,ADR+NS-A組均采用經(jīng)頸動(dòng)脈途徑腎動(dòng)脈插管方式行腎動(dòng)脈造影,然后ADR+MSCs-A組再經(jīng)插管予MSCs, ADR+NS-A組則經(jīng)插管予等量生理鹽水(NS)替代MSCs。4組大鼠分別于末次細(xì)胞移植后的第1天、第7天各取4只大鼠處死,留血標(biāo)本和腎臟,行以下檢測(cè)：①血標(biāo)本檢測(cè)血常規(guī),以及同時(shí)檢測(cè)血肌酐與血清尿素氮；②觀察4組大鼠的腎臟組織在光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)發(fā)生的變化。結(jié)果1.經(jīng)過(guò)酶作用消化后的原代細(xì)胞在24-48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)發(fā)生貼壁的情況,1周之后生長(zhǎng)速度較快,以平行排列方式進(jìn)行增長(zhǎng),在第2、第3周后能夠形成70%融合的貼壁細(xì)胞層,反復(fù)傳代后獲得形態(tài)均一的細(xì)胞,呈梭形,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD90等MSCs標(biāo)記物,不表達(dá)CD45及CD11b。P2代細(xì)胞成骨定向需要誘導(dǎo)14天,后可以看見(jiàn)細(xì)胞之間有黑色細(xì)小顆粒,該現(xiàn)象提示了有礦化基質(zhì)的沉積,成脂肪定向誘導(dǎo)需要14天,后表現(xiàn)出油紅-O染色強(qiáng)陽(yáng)性。P4代細(xì)胞生長(zhǎng)速度快,放置于2%O2、5% CO2、93%N2的環(huán)境中,48小時(shí)后,細(xì)胞缺氧的情況發(fā)生,Ad5／F35腺病毒攜帶的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)染液進(jìn)行轉(zhuǎn)染,之后需要培養(yǎng)6小時(shí),再加等容量的L-DMEN,經(jīng)過(guò)24小時(shí)后,在倒置顯微鏡下細(xì)致觀察熒光表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)綠色熒光表達(dá)率為75%,其表現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)和正常的培養(yǎng)細(xì)胞并無(wú)明顯差別。正常培養(yǎng)的BMSCs表面CXCR4表達(dá)很弱,缺氧條件下培養(yǎng)的BMSCs表面的CXCR4表達(dá)明顯增強(qiáng)。2.①各時(shí)間點(diǎn)Sham+MSCs-V組、Sham+MSCs-A組的體重增長(zhǎng)、血紅蛋白、血尿素氮、血肌酐水平與Sham比較沒(méi)有顯著差異(P0.05)。②各時(shí)間點(diǎn)ADR組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組的腎功能(血尿素氮、血肌酐)、24h尿蛋白定量明顯高于Sham組(P0.05)。末次注射干細(xì)胞的第0周,與ADR組比較,ADR+MSCs-A組的24h尿微量蛋白降低(P0.01)。末次注射干細(xì)胞后第1周,ADR+MSCs-A組的血肌酐較ADR組和ADR+MSCs-V組均降低 (P0.01),且24 h尿蛋白、24 h尿微量蛋白明顯低于ADR+MSCs-V組(P0.01)：第2周時(shí),盡管ADR+MSCs-A組的血肌酐較ADR組降低(P0.01),但與ADR+MSCs-V組之間的差異不再明顯。③ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組大鼠的血清白蛋白水平和24h尿量較ADR組有明顯提高(P0.05),而血清鈉濃度和24h尿蛋白定量較ADR組有明顯降低(血清鈉：P0.05；24h尿蛋白定量：P0.01)。以上檢測(cè)指標(biāo)在ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組之間無(wú)顯著差異。④Sham組腎臟的腎小球、腎間質(zhì)、腎小管沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的病變情況。ADR組腎臟的腎小管、腎小球、腎間質(zhì)均有不同程度受損。ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組在腎間質(zhì)炎癥病理改變上較ADR組程度上更輕,范圍更小。⑤與ADR組比較,ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組大鼠的血清白蛋白濃度和24h尿量增加(P0.05),血清鈉濃度和24h尿蛋白定量降低(P0.05),腎臟AQP1、AQP2的表達(dá)明顯降低(P0.05),ADR組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)退行性變,MSCs移植改善了其超微結(jié)構(gòu)。3.①GFP標(biāo)記的MSCs移植后1天,在ADR+MSCs-V組發(fā)現(xiàn)分布在腎小管,在ADR+MSCs-A組除了腎小管之外,腎小球也有少量分布。之后逐漸增加,14天時(shí)最明顯;②ADR組大鼠腎組織內(nèi)SDF-1表達(dá)較Sham組明顯增加(P0.05),并隨著時(shí)間推移而逐漸增加；③經(jīng)缺氧培養(yǎng)的異體骨髓MSCs移植后,SDF-1表達(dá)較ADR組降低,在14d有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組之間無(wú)顯著差異。4.①第1天時(shí),與ADR組比較,ADR+MSCs-A組、ADR+NS-A組的腎功能指標(biāo)和血紅蛋白含量均無(wú)明顯差異(P0.05)：第7天時(shí),與ADR組比較,ADR+NS-A組的腎功能指標(biāo)和血紅蛋白含量仍無(wú)明顯差異(P0.05),但ADR+MSCs-A組的血尿素氮和血肌酐明顯降低(P0.05),血紅蛋白含量明顯升高(P0.05)。②光鏡下大鼠腎臟病理顯示,與ADR組比較,ADR+NS-A組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)損傷程度與ADR組相當(dāng),但ADR+MSCs-A組在腎間質(zhì)炎癥病理改變的程度上更輕,范圍更小。結(jié)論1.培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,符合干細(xì)胞特征。在缺氧條件下培養(yǎng),細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)增加。2.同種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植是安全的,在移植后一段時(shí)間內(nèi),MSCs經(jīng)腎動(dòng)脈移植的效果優(yōu)于經(jīng)外周靜脈移植。MSCs移植可降低大鼠尿蛋白排泄,提高血清白蛋白水平,降低血鈉水平,下調(diào)AQP1、AQP2的過(guò)度表達(dá),從而保護(hù)了腎臟。3.在阿霉素慢性腎病大鼠腎組織內(nèi),SDF-1表達(dá)增加可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移增加有一定關(guān)系；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療阿霉素腎病的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。4.腎動(dòng)脈造影并移植間充質(zhì)干細(xì)胞有利于慢性腎衰大鼠腎臟損傷的修復(fù),該方法可以模擬臨床介入腎動(dòng)脈移植干細(xì)胞的方式,在實(shí)驗(yàn)研究中可以應(yīng)用推廣。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1545369