本文關(guān)鍵詞： 內(nèi)皮祖細(xì)胞 內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞 共培養(yǎng) 脊髓損傷　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：利用神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)修復(fù)脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)的實(shí)驗(yàn)研究主要有兩種方法。一種方法是通過移植外源性NSCs到損傷部位,通過外源性NSCs的增殖和分化,替代因損傷而缺失的神經(jīng)元細(xì)胞,重建神經(jīng)通路從而修復(fù)損傷脊髓；另一種方法是通過各種手段誘導(dǎo)損傷部位的脊髓內(nèi)源性NSCs增殖和分化,替代因損傷而缺失的神經(jīng)元細(xì)胞,重建神經(jīng)通路來修復(fù)損傷脊髓。當(dāng)前的研究表明將外源性NSCs移植到損傷部位實(shí)質(zhì)上只是改善了損傷部位局部的內(nèi)環(huán)境,最終還是通過脊髓內(nèi)環(huán)境的改善從而誘導(dǎo)和促進(jìn)脊髓內(nèi)源性NSCs的神經(jīng)生發(fā)來修復(fù)損傷脊髓。神經(jīng)生發(fā)往往伴隨著血管生發(fā),提示血管因素在神經(jīng)損傷修復(fù)的過程中占有重要的地位,有效的血管生發(fā)應(yīng)該能帶來脊髓微環(huán)境的明顯改善,從而誘導(dǎo)損傷部位的神經(jīng)生發(fā)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一種能夠在外周血中分離培養(yǎng)獲得,能有效促進(jìn)組織血管生發(fā)的干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分離培養(yǎng)SD大鼠外周血的EPCs并移植入SCI大鼠的損傷脊髓,通過改善損傷脊髓內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs的神經(jīng)生發(fā)重建神經(jīng)通路以修復(fù)損傷脊髓。研究首先分離培養(yǎng)大鼠外周血EPCs和脊髓內(nèi)源性NSCs,然后在體外進(jìn)行外周血EPCs與脊髓內(nèi)源性NSCs的共培養(yǎng),通過倒置顯微鏡觀察和免疫組化方法鑒定外周血EPCs對(duì)脊髓內(nèi)源性NSCs增殖與分化情況的影響并測定培養(yǎng)上清液的血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)變化,研究其機(jī)制。接著將外周血EPCs移植入SCI大鼠模型的損傷部位,通過BBB評(píng)分、Rivlin斜扳試驗(yàn)觀察SCI的恢復(fù)情況,通過組織學(xué)觀察神經(jīng)元再生情況、免疫熒光染色的方法觀察脊髓內(nèi)源性NSCs的增殖分化情況,鑒定EPCs對(duì)神經(jīng)生發(fā)的促進(jìn)作用,測定損傷脊髓VEGF的表達(dá)變化反映外周血EPCs對(duì)脊髓神經(jīng)功能的修復(fù)的作用機(jī)制。為實(shí)現(xiàn)白體外周血EPCs誘導(dǎo)脊髓內(nèi)源性NSCs生發(fā)有效修復(fù)SCI的臨床應(yīng)用打下研究基礎(chǔ)。本研究分四個(gè)部分,在實(shí)驗(yàn)一中取5-7 d的SPF級(jí)新生SD大鼠,頸椎脫臼法處死,無菌條件下取出胸腰段脊髓組織,去除血管和軟脊膜等多余組織后將其剪碎,過濾,離心,分離,并用NSCs培養(yǎng)液成功分離培養(yǎng)出懸浮生長的細(xì)胞球,經(jīng)免疫組化鑒定能表達(dá)NSCs的特異性抗原Nestin,加入血清繼續(xù)培養(yǎng)后能分化為帶有軸突和樹突的細(xì)胞,經(jīng)免疫組化鑒定能表達(dá)神經(jīng)元特異性抗原β-tubulin-Ⅲ,即為神經(jīng)元,ELISA測定其培養(yǎng)7d上清液可見VEGF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表達(dá),說明該分離培養(yǎng)的細(xì)胞可以確定為大鼠脊髓內(nèi)源性NSCs,并能分泌VEGF和BDNF。在實(shí)驗(yàn)二中取體重為90-120 g的雄性SPF級(jí)SD大鼠行10%水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔麻醉,麻醉滿意后在無菌條件下取頸部正中切口,剪開皮膚及皮下組織向兩邊翻開并固定,沿肌肉間隙仔細(xì)分離至暴露雙層頸動(dòng)脈,然后用無菌采血管取雙側(cè)頸動(dòng)脈的血液,約10 ml,取血完成后立即轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)中,按照淋巴細(xì)胞分離液試劑盒的操作說明分離出單個(gè)核細(xì)胞層,離心洗滌細(xì)胞,所獲得的細(xì)胞沉淀以EBM-2完全培養(yǎng)基重懸,以5×105/ml細(xì)胞濃度接種到含有預(yù)先FN包被過的蓋玻片的24孔板中,37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。約9d左右,細(xì)胞融合度達(dá)到約90%后傳代。細(xì)胞形態(tài)鏡下觀察符合文獻(xiàn)報(bào)道的鋪路石樣排列。經(jīng)免疫組化鑒定能表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD133及VEGFR-2,攝取Dil-Ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1雙陽性,說明成功分離培養(yǎng)出大鼠外周血EPCs。ELISA測定其培養(yǎng)7d上清液可見VEGF大量表達(dá)、BDNF少量表達(dá),說明大鼠外周血EPCs可以大量分泌VEGF。在實(shí)驗(yàn)三中將實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)分為NSCs培養(yǎng)對(duì)照組,EPCs與NSCs共培養(yǎng)組和抗VEGF組(加入VEGF抗體的EPCs與NSCs共培養(yǎng)組)。NSCs培養(yǎng)對(duì)照組：收集純化后培養(yǎng)的第3代NSCs,吹打成單細(xì)胞懸液后接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7 d,觀察其生長情況,然后用5%血清誘導(dǎo)培養(yǎng)NSCs7天,觀察其分化情況。EPCs和NSCs共培養(yǎng)組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上在孔內(nèi)放置24孔板Transwell,取載有貼壁原代生長良好EPCs蓋玻片,EPCs置于Transwell膜上,NSCs位于Transwell膜下,培養(yǎng)7 d,觀察NSCs生長情況,然后移走EPCs及Transwell膜,加5%血清誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)NSCs 7 d,觀察其分化情況。抗VEGF組：在EPCs和NSCs共培養(yǎng)組的基礎(chǔ)上再培養(yǎng)液內(nèi)加入VEGF抗體(200 pg/ml),培養(yǎng)7 d,觀察NSCs生長情況,然后移走EPCs及Transwell膜,加5%血清誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)NSCs 7 d,觀察其分化情況。結(jié)果在倒置顯微鏡下觀察可見7d時(shí),共培養(yǎng)組神經(jīng)球數(shù)量比對(duì)照組明顯多,而且球直徑明顯增大,共培養(yǎng)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；5%血清誘導(dǎo)培養(yǎng)NSCs7天后,行β-tubulin-Ⅲ免疫熒光染色,在顯微鏡下計(jì)算β-tubulin-Ⅲ+/細(xì)胞總數(shù)得出百分率,共培養(yǎng)組明顯高于對(duì)照組(P0.05)。ELISA法檢測各組培養(yǎng)7d上清液VEGF水平,發(fā)現(xiàn)抗VEGF組的VEGF表達(dá)明顯低于共培養(yǎng)組(P0.05),而誘導(dǎo)NSCs的增殖分化能力也顯著降低(P0.05)。說明外周血EPCs在體外能明顯促進(jìn)脊髓源性NSCs的增殖與分化并與EPCs分泌VEGF有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)四中我們將4月齡的SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為EPCs移植組,NSCs移植組和對(duì)照組,每組24只。術(shù)前三天至術(shù)后一周每天BrdU(50μg/g)腹腔注射,采用改良Allen's法制備大鼠SCI模型后,EPCs移植組應(yīng)用Hamilton微量注射器在SCI處近端約0.5～1.0mm向脊髓內(nèi)注入EPCs 5μl,細(xì)胞總數(shù)5×105/ml。NSCs移植組應(yīng)用Hamilton微量注射器在SCI處近端約0.5～1.0mm向脊髓內(nèi)注入NSCs 5μl,細(xì)胞總數(shù)5×105/ml。對(duì)照組應(yīng)用Hamilton微量注射器在SCI處近端約0.5～1.0mm向脊髓內(nèi)注入生理鹽水5μl。在術(shù)后1、2、4、6周采用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分系統(tǒng),Rivlin斜板運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)檢測大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況；采用組織學(xué)觀察和免疫熒光雙標(biāo)染色檢測脊髓組織病理變化情況以及EPCs對(duì)內(nèi)源性NSCs增殖分化的影響；ELISA試驗(yàn)檢測各組脊髓組織VEGF表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),手術(shù)后2、4、6周運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分EPCs移植組BBB評(píng)分明顯高于NSCs移植組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。組織學(xué)觀察示EPCs移植組脊髓結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)元形態(tài)恢復(fù)較好且逐漸趨于正常,免疫熒光雙標(biāo)染色示EPCs移植組脊髓組織中BrdU+/MAP-2+細(xì)胞數(shù)較NSCs移植組明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ELISA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EPCs移植組脊髓組織中VEGF表達(dá)明顯高于NSCs移植組(P0.05)。這些結(jié)果提示EPCs能夠在體內(nèi)環(huán)境中誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs增殖和分化從而促進(jìn)SCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)并且優(yōu)于NSCs移植。該作用可能與EPCs移植后通過VEGF分泌改善SCI微環(huán)境有關(guān)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功在大鼠脊髓組織提取脊髓內(nèi)源性NSCs和在外周血中分離出EPCs,外周血EPCs在體外能通過VEGF明顯促進(jìn)脊髓內(nèi)源性NSCs增殖和分化。在SCI大鼠中移植EPCs能夠誘導(dǎo)脊髓內(nèi)源性NSCs增殖和分化,促進(jìn)SCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)并優(yōu)于NSCs移植,該作用可能與EPCs移植后VEGF分泌的增加改善SCI微環(huán)境有關(guān)。
[Abstract]:In order to study the effect of EPCs on the proliferation and differentiation of spinal cord injured spinal cord ( SCI ) , the effect of EPCs on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells in spinal cord was studied by means of reversed microscopic observation and immunohistochemical method . The expression of VEGF and brain - derived neurotrophic factor ( BDNF ) in peripheral blood of rats were determined by immunohistochemistry . The expression of VEGF in the spinal cord was significantly higher than that in the control group ( P0.05 ) . The results showed that the VEGF expression of the group was significantly higher than that in the control group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡浪;李大鵬;黃永輝;;正常及退變髓核細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核方向分化效果比較[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年05期

2 趙艷梅;鐘國強(qiáng);柯紅紅;李金軼;;體外不同誘導(dǎo)條件對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2010年06期

3 梁亮;孫沫逸;李建虎;楊永勤;申志遠(yuǎn);蘇忠平;;誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為唾液腺腺泡樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國美容醫(yī)學(xué);2012年03期

4 張春敏;朱靜;燕莎;崔建邦;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞微環(huán)境中瘤性轉(zhuǎn)化的生物學(xué)分析[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年05期

5 劉玲玲;趙龍;李曉麗;張贏予;王好;周艷芳;張國輝;;MSCs旁分泌對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年03期

6 馮月蘭;徐國興;謝茂松;;視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液聯(lián)合視黃酸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用[J];海峽科學(xué);2010年05期

7 張瑾;張子琦;張滟;許珉;;微囊化軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外定向分化[J];中國組織工程研究;2014年30期

8 李天然;杜湘珂;宋斌;葉玉坤;魏正茂;霍天龍;;TGFβ1轉(zhuǎn)染hMSC對(duì)MHCC97-H影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2013年07期

9 張蕾;陳槐卿;Nguyen.Tran;;與韌帶成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膠原蛋白和韌粘素-C表達(dá)的影響[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2007年04期

10 劉亮,張曉啟,劉旭盛,明佳,徐輝,程天民;巨噬細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞周期和VEGF受體、HOXB2 mRNA表達(dá)的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2004年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前2條

1 黃鴻眉;程茜;;雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞生長和白介素-8分泌功能的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

2 叢明宇;趙亮;于維先;孫宏晨;;促紅細(xì)胞生成素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑效應(yīng)的影響[A];第十次全國牙周病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 杜怡斌;內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)生發(fā)促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 文燦;離體脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元—頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突觸形成及特征的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

3 錢德慧;血管內(nèi)皮Jagged1在調(diào)節(jié)老齡相關(guān)平滑肌增生中的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

4 李紅華;人胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化體外模型的建立及分化機(jī)制初探[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

5 張蕾;機(jī)械牽張和間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向韌帶細(xì)胞分化的體外研究[D];四川大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 李書壇;研究BMP-2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的影響[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

2 孟虎;骨橋蛋白誘導(dǎo)角膜新生血管形成機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京大學(xué);2014年

3 張素麗;牛子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)體系對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

4 楊文;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外調(diào)控肝星狀細(xì)胞死亡受體5的表達(dá)[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

5 徐清云;長春新堿逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)白血病門冬酰胺酶耐藥的研究[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2014年

6 王秀嬌;嗅鞘細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及向膽堿能神經(jīng)元分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];佳木斯大學(xué);2010年

7 劉晶晶;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)源性白細(xì)胞介素-6的分泌機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

8 寧琳;BMSCs調(diào)控尿激酶型纖溶酶原激活物及其抑制劑促進(jìn)大鼠HSCs凋亡機(jī)制[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：1536606