本文關(guān)鍵詞： 順鉑 miRNA 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 細(xì)胞增殖 基因表達(dá)　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童時(shí)期最常見的惡性腫瘤,平均發(fā)病年齡為17個(gè)月。腫瘤起源于神經(jīng)嵴組織,發(fā)生在人體深部腎上腺髓質(zhì)和椎旁神經(jīng)節(jié)位置。由于沒有特定的臨床表現(xiàn),大約50%到60%的患者被確診時(shí)已到晚期。經(jīng)過多學(xué)科治療,甚至引入劑量密集化療方案,但高風(fēng)險(xiǎn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后仍然無明顯改善,5年生存率小于50%。 MicroRNAs(miRNAs)是非編碼小RNA,參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。通過與靶mRNA不完全結(jié)合,導(dǎo)致翻譯抑制或靶基因的不穩(wěn)定。miRNA可作為腫瘤抑制基因和癌基因。研究表明,miR-106a在胃癌組織中過表達(dá),具有致瘤作用。miR-16作為腫瘤抑制基因,通過調(diào)節(jié)BMIl,在套細(xì)胞淋巴瘤SP細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致裸鼠淋巴瘤移植瘤縮小。 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員,通過與其特異性受體TrkB結(jié)合,在神經(jīng)元存活、分化、和軸突延伸過程中起著非常關(guān)鍵的作用。研究表明,BDNF-TrkB信號(hào)通路不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長,而且還影響許多腫瘤,如肺癌,膀胱癌,胰腺癌等的發(fā)生、侵襲和預(yù)后。最近的一項(xiàng)研究表明,BDNF能增強(qiáng)移行細(xì)胞癌的增殖和存活。BDNF高表達(dá)與腫瘤(包括胰腺癌和乳腺癌)惡化有關(guān)。 順鉑是治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的有效藥物,它可以抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長,然而有關(guān)順鉑抗腫瘤作用的分子機(jī)制還不明確。在以往的研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)在順鉑治療后明顯下降,而miR-21又可以下調(diào)MSH2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,這一結(jié)果提示我們探討順鉑作用后引起的miRNA表達(dá)變化,并檢測下游分子的改變,能夠進(jìn)一步明確順鉑抗癌機(jī)制,也為新型抗癌藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)�；趍iR-16和BDNF目前公認(rèn)的作用,以及二者之間可預(yù)測的相關(guān)性,在本研究中,我們選擇miR-16和BDNF作為研究對象,來探討順鉑抗腫瘤作用的分子機(jī)制。 為了明確順鉑、miR-16和BDNF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤內(nèi)的表達(dá)情況以及三者之間的相關(guān)性,本研究設(shè)計(jì)三部分實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行：(一)研究順鉑抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長及相關(guān)分子miR-16、BDNF的表達(dá)變化；(二)研究miR-16抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長的機(jī)制；(三)研究順鉑對SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤的抑制及影響機(jī)制。 第一部分順鉑抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長及相關(guān)分子miR-16、BDNF表達(dá)變化的研究 目的： 研究順鉑對SH-SY5Y細(xì)胞生長的影響,闡明順鉑作用后miR-16和BDNF兩種分子在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。 方法： 取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)過夜后,每孔加入不同劑量的順鉑,使培養(yǎng)基中的順鉑濃度分別為0μg/ml,1.5μg/ml；3μg/ml；4.5μg/ml;6μg/ml;12μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)48h后,分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：放在倒置相差顯微鏡下,觀察細(xì)胞的狀態(tài)和數(shù)量；向培養(yǎng)孔內(nèi)加入MTT溶液,4h后棄掉培養(yǎng)基,每孔加100μl DMSO溶解結(jié)晶,570nm波長測量吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：使用Annexin V-FITC和PI對收集的細(xì)胞進(jìn)行雙染,通過流式細(xì)胞儀檢測,分析不同濃度下各組的細(xì)胞凋亡率；收集順鉑作用后的SH-SY5Y細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,并通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-16的表達(dá)水平；提取細(xì)胞蛋白,進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,用BDNF抗體進(jìn)行雜交,再通過酶標(biāo)的二抗使底物顯色,拍照后觀察BDNF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。 結(jié)果： 隨著順鉑濃度的增加,視野下可見的活細(xì)胞密度逐漸減少,而漂浮的死細(xì)胞數(shù)目增多,細(xì)胞密度降低；MTT結(jié)果顯示,當(dāng)順鉑濃度達(dá)到6μg/ml時(shí),細(xì)胞生長抑制率已超過一半,并且抑制率與順鉑的濃度呈正相關(guān)；通過流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果顯示,0gg/ml組細(xì)胞凋亡率明顯低于順鉑作用后的各組,并且隨著順鉑濃度的升高,細(xì)胞凋亡率逐步升高；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,順鉑作用后,SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)miR-16表達(dá)顯著升高；Western blotting測定細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá),在順鉑濃度達(dá)到3μg/ml后,細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)水平顯著降低。 結(jié)論： 順鉑可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長,引起細(xì)胞凋亡增加；同時(shí),順鉑還可以使細(xì)胞內(nèi)miR-16表達(dá)升高；相反的,在順鉑作用后細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)降低。 第二部分miR-16抑制(?)H-SY5Y細(xì)胞生長機(jī)制的研究 目的： 明確miR-16對SH-SY5Y細(xì)胞生長的影響,預(yù)測miR-16與BDNF的相關(guān)性,并證明miR-16對BDNF表達(dá)的影響。 方法： 化學(xué)合成miR-16的雙鏈寡核苷酸鏈,當(dāng)培養(yǎng)板內(nèi)的SH-SY5Y細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí),通過脂質(zhì)體法將miR-16或陰性對照的寡核苷酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：在倒置相差顯微鏡下,觀察細(xì)胞的狀態(tài)和數(shù)量；通過MTT法測定各組細(xì)胞的吸光度值,并通過公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率；Annexin V-FITC和PI雙染后,通過流式細(xì)胞儀檢測miR-16誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率；通過生物信息學(xué)分析,預(yù)測miR-16與BDNF的相關(guān)性；通過Western blotting技術(shù)檢測miR-16轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后BDNF的表達(dá)水平。 結(jié)果： SH-SY5Y細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-16后,細(xì)胞數(shù)量較正常對照和轉(zhuǎn)染NC組明顯減少,細(xì)胞密度降低,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生變化,貼壁程度有所減輕；MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率,結(jié)果表明,較正常對照組和NC組,miR-16轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(見圖7),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。Annexin V-FITC/PI雙染后,轉(zhuǎn)染miR-16的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率達(dá)到33.7%,與對照組相比明顯升高；為了證實(shí)miR-16與BDNF之間的相關(guān)性,我們通過生物信息學(xué)分析的方法,發(fā)現(xiàn)在BDNF-3'-UTR存在miR-16的匹配位點(diǎn)；進(jìn)一步通過Western blotting檢測,結(jié)果顯示,BDNF在miR-16作用后表達(dá)量明顯降低。 結(jié)論： miR-16可以發(fā)揮抑癌基因的功能,抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡；BDNF-3'-UTR區(qū)域存在miR-16的匹配位點(diǎn)；miR-16可以下調(diào)癌基因BDNF的表達(dá)而發(fā)揮作用。 第三部分順鉑對SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤的抑制及機(jī)制研究 目的： 在個(gè)體水平,探討順鉑對裸鼠移植瘤生長的影響；進(jìn)一步證明順鉑可以影響移植瘤細(xì)胞中miR-16和BDNF的表達(dá),在個(gè)體水平證明順鉑可以升高miR-16的表達(dá),而后者可進(jìn)一步下調(diào)BDNF的表達(dá)。 方法： 大量培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,準(zhǔn)備注射到裸鼠背部皮下造模；通過腹腔注射戊巴比妥鈉使裸鼠麻醉后,每個(gè)點(diǎn)注射1×107個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞；當(dāng)腫瘤體積增大到大約100mm3時(shí),對實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹腔注射順鉑進(jìn)行干預(yù),順鉑用量為3mg/kg,對照組腹腔注射等體積的生理鹽水；順鉑每四天注射1次,共治療4次；最后一次注射結(jié)束后的第四天,將裸鼠處死,然后將瘤體從背部皮下取出；將同組處理的瘤體放在一起觀察,拍照；用電子天平稱量每個(gè)瘤體的重量,記錄并計(jì)算均值；提取細(xì)胞RNA,通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測瘤體細(xì)胞內(nèi)miR-16的表達(dá)水平；提取瘤體內(nèi)總蛋白后,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印、抗體雜交等步驟,最后放入化學(xué)發(fā)光成像儀,拍照觀察蛋白條帶,分析BDNF在裸鼠移植瘤內(nèi)的表達(dá)情況。 結(jié)果： 注射SH-SY5Y細(xì)胞至裸鼠背部皮下后,每天觀察成瘤情況,并測量估算瘤體大�。患s5-7天后,瘤體體積達(dá)到大約100mm3,開始使用順鉑對實(shí)驗(yàn)組裸鼠進(jìn)行干預(yù)；治療完畢,取出細(xì)胞移植瘤,可見順鉑處理組腫瘤體積明顯減小,順鉑在裸鼠體內(nèi)可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖；使用精密電子天平稱量瘤體的重量,注射生理鹽水組的瘤重為0.135±0.015g,而順鉑干預(yù)后瘤重為0.057±0.018g；實(shí)時(shí)定量PCR檢測瘤體內(nèi)miR-16的表達(dá),結(jié)果顯示與對照組相比,在順鉑干預(yù)后,瘤體內(nèi)miR-16表達(dá)顯著升高,這一結(jié)果與細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的；Western blotting檢鋇SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤體內(nèi)BDNF的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在順鉑干預(yù)后,瘤體細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)水平顯著減低。 結(jié)論： 順鉑可以抑制裸鼠SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤的生長；順鉑可以增加瘤體細(xì)胞內(nèi)miR-16的表達(dá)水平,相反,瘤體內(nèi)BDNF的表達(dá)水平降低。 三部分整體結(jié)論： 順鉑可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,也可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長；順鉑可以通過升高miR-16的表達(dá)發(fā)揮作用,而miR-16可以抑制細(xì)胞和裸鼠移植瘤體內(nèi)BDNF的表達(dá)；在細(xì)胞和個(gè)體水平,順鉑都能通過上調(diào)miR-16表達(dá),進(jìn)而下調(diào)BDNF表達(dá),來發(fā)揮抑制細(xì)胞生長的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Mei Liu;Xin Zhang;Chen-Fei Hu;Qing Xu;Hong-Xia Zhu;Ning-Zhi Xu;;MicroRNA-mRNA functional pairs for cisplatin resistance in ovarian cancer cells[J];Chinese Journal of Cancer;2014年06期

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本文編號(hào)：1525709