本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)干細胞 細胞培養(yǎng) 體外分化 免疫組化 神經(jīng)導管 外周神經(jīng)缺損　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：神經(jīng)元屬于永久性細胞,損傷后不能以分裂增殖的方式進行修復。傳統(tǒng)神經(jīng)缺損修復方法以神經(jīng)外膜、束膜縫合為主,后又出現(xiàn)外周神經(jīng)導管修復技術(shù),且應(yīng)用日趨廣泛。于神經(jīng)斷端放置不同材質(zhì)的套管,創(chuàng)造了加速斷端吻合的微環(huán)境。微環(huán)境內(nèi)各類神經(jīng)營養(yǎng)因子富集,有利于斷端吻合。將神經(jīng)干細胞與神經(jīng)導管相復合共同修復外周神經(jīng)缺損,使神經(jīng)導管不單具有支持、導向的物理作用,更有促進神經(jīng)再生的化學、生物作用,從而可提升修復效果。 神經(jīng)導管復合神經(jīng)干細胞修復外周神經(jīng)缺損,神經(jīng)干細胞可分化為具有分泌功能的各類神經(jīng)細胞,分泌神經(jīng)生長因子及各類神經(jīng)營養(yǎng)因子,加速神經(jīng)斷端吻合,加之套管創(chuàng)造斷端吻合的微環(huán)境,使斷端周圍各類神經(jīng)營養(yǎng)因子保持在較高濃度水平,更有利于愈合。雪旺細胞存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng),作為神經(jīng)干內(nèi)主要的非神經(jīng)元活性細胞,不僅可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,同時還產(chǎn)生細胞外基質(zhì)和細胞黏附因子,對促進周圍神經(jīng)生長發(fā)育、再生和修復起重要作用。 神經(jīng)干細胞是一類具有自我更新及不對稱分裂能力的細胞群,主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。其具有強大的增殖分裂能力及多向分化潛能,通過不對稱分裂,在產(chǎn)生新的神經(jīng)干細胞,以維持自身數(shù)量恒定狀態(tài)的同時,還可根據(jù)周圍神經(jīng)、體液因子的調(diào)節(jié)及損傷因素的影響產(chǎn)生出具有特定功能的前體細胞,進而參加神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及修復過程。神經(jīng)干細胞主要具有如下特性：較強的增殖分裂與自我更新能力、多向分化潛能、弱免疫原性及較強的遷徙能力。 作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期階段的幼稚細胞,神經(jīng)干細胞突起尚未形成,細胞表面的特定免疫原性蛋白分子尚未完全表達,細胞免疫原性較弱,為神經(jīng)干細胞在已經(jīng)發(fā)育完善的成體中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復中奠定了重要的基礎(chǔ),后期免疫排斥反應(yīng)較弱,有利于移植細胞的存活。同時,神經(jīng)干細胞具有強大的增殖分裂能力、多向分化潛能及較強的遷徙能力,可接受病變部位神經(jīng)源性信號的影響,參與神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的修復。有文獻報道在外周神經(jīng)缺損的修復中添加神經(jīng)干細胞可以促進神經(jīng)斷端吻合及后期功能恢復,起到良好的修復效果。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)的重建和再生提供了一個新的思路,打破了神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能再生,只能由星形膠質(zhì)細胞增生、瘢痕組織代替缺失神經(jīng)元的傳統(tǒng)觀念。 與此同時,神經(jīng)干細胞的研究還存在諸多問題：如定向誘導分化是神經(jīng)干細胞應(yīng)用于臨床的一個關(guān)鍵問題。移植后到達損傷部位的神經(jīng)干細胞不能分化為具有針對性補充、修復功能的特定細胞,會導致移植治療后顯效慢,修復效果不佳,影響療效,甚至導致局部炎癥反應(yīng)、移植后腦內(nèi)瘤樣團塊形成壓迫周圍組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)瘤生成,加重損傷程度。迄今尚難獲得來源于同一譜系,分化程度一致,細胞無異質(zhì)性的神經(jīng)干細胞,對神經(jīng)干細胞移植治療標準、療效評價的制定造成影響。 外周神經(jīng)缺損多因外傷導致,導致?lián)p傷平面以下的支配區(qū)出現(xiàn)感覺、功能障礙。自體神經(jīng)移植是外周神經(jīng)缺損修復的金標準,其術(shù)式經(jīng)典,且具有一定的療效,但此方法對供區(qū)神經(jīng)造成毀損,影響供區(qū)感覺、運動功能。異種生物型神經(jīng)導管具有良好的通透性、機械強度及降解性,通過去抗原技術(shù),去除了免疫原性且適宜細胞種植貼附,具有良好的應(yīng)用前景。 目前神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)多取材于鼠,而相關(guān)大動物的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)報道則相對較少。另外,目前已知添加神經(jīng)干細胞可促進外周神經(jīng)缺損修復,提高修復效果,但添加神經(jīng)干細胞后其轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)歸過程尚不明確。本實驗主要對異種生物型神經(jīng)導管修復山羊腓總神經(jīng)缺損的效果及神經(jīng)干細胞修復外周神經(jīng)缺損的療效及臨床安全性予以論證,以初生山羊腦組織為材料分離培養(yǎng)山羊神經(jīng)干細胞,模擬體內(nèi)環(huán)境對神經(jīng)干細胞進行誘導分化,并應(yīng)用免疫組化方法檢測分化產(chǎn)物,明確神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)歸過程。 本實驗分為四部分,第一部分主要論述山羊神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液、誘導分化培養(yǎng)液及山羊雪旺細胞培養(yǎng)液的制備及細胞培養(yǎng)取材、分離培養(yǎng)方法,探討神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及誘導分化的基本條件；第二部分主要為山羊神經(jīng)干細胞、山羊雪旺細胞免疫組化檢測方法與步驟；第三部分主要論述山羊神經(jīng)干細胞體外誘導分化的步驟及相關(guān)分化產(chǎn)物的免疫組化檢測、后期相關(guān)圖像處理及統(tǒng)計學分析；第四部分論述以異種生物型導管聯(lián)合同種異體神經(jīng)干細胞修復山羊腓總神經(jīng)缺損的效果,同時對神經(jīng)干細胞移植后轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)歸過程進行討論。 第一部分山羊神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液、誘導分化培養(yǎng)液、山羊雪旺細胞培養(yǎng)液的制備及山羊神經(jīng)干細胞、雪旺細胞分離培養(yǎng) 目的： 探討山羊神經(jīng)干細胞、山羊雪旺細胞培養(yǎng)條件、山羊神經(jīng)干細胞體外誘導分化條件；以手術(shù)方法獲得1日齡山羊腦組織進行神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)、獲得坐骨神經(jīng)進行雪旺細胞分離培養(yǎng)。方法： 1.山羊神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液配制 取DMEM-F12培養(yǎng)基47m1、N2添加劑0.5ml、B27添加劑lml配制成100ml培養(yǎng)液,加入成纖維細胞生長因子[bFGF]、表皮生長因子[EGF]各0.8μg配制成山羊神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液。 2.山羊神經(jīng)干細胞誘導分化培養(yǎng)液配制 取DMEM-F12培養(yǎng)基37ml、胎牛血清10ml、N2添加劑0.5ml、B27添加劑lml配制成誘導分化培養(yǎng)液。 3.山羊雪旺細胞培養(yǎng)液配制 取DMEM培養(yǎng)基40ml、胎牛血清l0ml配置成山羊雪旺細胞培養(yǎng)液。 4.山羊神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng) 山羊麻醉后開顱,手術(shù)取出靠近皮質(zhì)及海馬部位腦組織,消化分散并培養(yǎng)5日后離心換液,繼續(xù)培養(yǎng)并傳代。 5.山羊雪旺細胞分離培養(yǎng) 手術(shù)取出山羊坐骨神經(jīng),剝離神經(jīng)外膜并剪碎消化后以組織塊法種植培養(yǎng)雪旺細胞,添加山羊雪旺細胞培養(yǎng)液并于2日后換液,繼續(xù)培養(yǎng)2日后傳代,每次傳代利用差速貼壁法去除成纖維細胞,純化雪旺細胞。 結(jié)果： 1.成功配制山羊神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液,其中bFGF、EGF濃度均為16ng/ml,B27體積分數(shù)2%,N2體積分數(shù)1%。 2.成功配制山羊神經(jīng)干細胞誘導分化培養(yǎng)液,其中含胎牛血清20%、N2添加劑1%、B27添加劑2%,不含EGF及bFGF。 3.成功配制山羊雪旺細胞培養(yǎng)液,其中含胎牛血清20%。 4.成功由山羊腦皮質(zhì)、海馬組織分離培養(yǎng)神經(jīng)球樣細胞團,鏡下觀察呈強折光性。 5.成功以山羊坐骨神經(jīng)分離培養(yǎng)梭形細胞,形態(tài)與雪旺細胞相同。 結(jié)論： 以含bFGF、EGF濃度16ng/ml,B27體積分數(shù)2%,N2體積分數(shù)1%的DMEM-F12培養(yǎng)基及組織塊法可成功分離培養(yǎng)類山羊神經(jīng)干細胞,待后期行抗-Nestin免疫組化染色可行確定。 第二部分山羊神經(jīng)干細胞、雪旺細胞免疫組化鑒定 目的： 以抗-Nestin免疫組化染色鑒定前期培養(yǎng)神經(jīng)球,確定其神經(jīng)干細胞屬性；以抗-S100免疫組化染色鑒定前期培養(yǎng)山羊雪旺細胞,為后期體外誘導分化產(chǎn)物行免疫組化鑒定設(shè)定抗-S100陽性對照組。 方法： 1.抗-Nestin免疫組化染色 實驗分為陽性組及陰性對照組。前期培養(yǎng)類山羊神經(jīng)干細胞進行抗-Nestin免疫組化染色并以SABC法顯色；陰性對照組以生理鹽水替代抗-Nestin一抗,余操作步驟及過程與陽性組相同。各組染色完成后于光鏡下觀察并拍照記錄。 2.抗-S100免疫組化染色 此步驟意在鑒定所培養(yǎng)類山羊雪旺細胞并設(shè)定陽性對照組,與后期山羊神經(jīng)干細胞體外誘導分化產(chǎn)物抗-S100免疫組化結(jié)果進行比較。類山羊雪旺細胞進行抗-S100免疫熒光染色并于染色完成后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。 結(jié)果： 染色得抗-Nestin、抗-S100陽性細胞,陰性對照組鏡下未見明顯陽性光點。 結(jié)論： 由山羊腦組織分離培養(yǎng)所得神經(jīng)球樣細胞團表達Nestin特異性蛋白,形態(tài)及蛋白標志物符合山羊神經(jīng)干細胞特性；由山羊坐骨神經(jīng)分離培養(yǎng)所得梭形細胞表達S100蛋白,形態(tài)及蛋白標志物符合山羊雪旺細胞特性。 第三部分山羊神經(jīng)干細胞體外誘導分化實驗及分化產(chǎn)物免疫組化鑒定 目的： 以山羊神經(jīng)干細胞誘導分化培養(yǎng)液模擬干細胞體內(nèi)分化環(huán)境,誘導山羊神經(jīng)干細胞進行體外誘導分化；以免疫熒光方法檢測山羊神經(jīng)干細胞體外誘導分化產(chǎn)物,同時對圖像結(jié)果進行灰度量化；對量化后的檢測結(jié)果陽性、陰性組進行統(tǒng)計學分析；探討神經(jīng)干細胞移植后在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)歸過程。 方法： 1.山羊神經(jīng)干細胞體外誘導分化 前期培養(yǎng)山羊神經(jīng)干細胞離心后去上清,并以山羊神經(jīng)干細胞誘導分化培養(yǎng)液重懸沉淀細胞繼續(xù)培養(yǎng)。 2.體外誘導分化產(chǎn)物免疫熒光染色 山羊神經(jīng)干細胞體外誘導分化產(chǎn)物分別行抗-MAP2、抗-GFAP、抗-S100免疫熒光染色。分組設(shè)置：分化產(chǎn)物抗-MAP2、抗-GFAP免疫熒光染色結(jié)果作為陽性組,陰性對照組以生理鹽水代替一抗,余步驟與方法同陽性組；分化產(chǎn)物抗-S100免疫熒光染色結(jié)果設(shè)為陰性組并與前述山羊雪旺細胞抗-S100染色陽性對照組進行比較。 3.染色結(jié)果圖像灰度量化及統(tǒng)計學分析 各染色組隨機取3個高倍視野,抗-MAP2、抗-GFAP及前述抗-Nestin、抗-S100染色陽性組每個視野隨機取2個陽性點,對應(yīng)陰性組每個視野隨機取間隔較遠的2點,各點以ImageJl.47圖像分析軟件進行灰度計算。計算均數(shù)后各組數(shù)據(jù)進行兩獨立樣本t檢驗,設(shè)定P0.05為具有顯著性差異。 結(jié)果： 1.成功對山羊神經(jīng)干細胞進行體外誘導分化,分化產(chǎn)物行免疫熒光染色抗-MAP2、抗-GFAP呈陽性反應(yīng),分化產(chǎn)物行抗-S100染色未檢見陽性產(chǎn)物。 2.各組免疫組化圖像結(jié)果量化后進行兩獨立樣本t檢驗,抗-Nestin染色、抗-MAP2染色、抗-GFAP染色各陽性組與陰性對照組比較P0.01,具有顯著性差異；分化產(chǎn)物與山羊雪旺細胞抗-S100免疫熒光染色結(jié)果進行比較P0.01,具有顯著性差異。 結(jié)論： 山羊神經(jīng)干細胞可由血清進行體外誘導分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞,分化產(chǎn)物行抗-S100免疫熒光染色未檢見陽性產(chǎn)物。 第四部分生物型導管聯(lián)合神經(jīng)干細胞修復山羊腓總神經(jīng)缺損的實驗研究 目的： 通過動物實驗證明添加神經(jīng)干細胞輔助治療外周神經(jīng)缺損的療效及安全性；進一步探究神經(jīng)干細胞移植治后轉(zhuǎn)歸過程；探索添加雪旺細胞與神經(jīng)干細胞混懸液對外周神經(jīng)缺損的修復效果。 方法： 1.制備生物型神經(jīng)導管 以豬的血管壁、小腸粘膜為原料,通過環(huán)氧交聯(lián)固定技術(shù)、多方位去抗原技術(shù)去除材料表面抗原,用膠原蛋白分子進行適當交聯(lián)提高堅韌性。 2.模型建立及實驗分組 手術(shù)建模,制作山羊腓總神經(jīng)4cm缺損模型。實驗分組：干細胞組以神經(jīng)導管吻合缺損斷端并于導管內(nèi)添加神經(jīng)干細胞懸液；混合細胞組以神經(jīng)導管吻合缺損斷端并于導管內(nèi)添加神經(jīng)干細胞／雪旺細胞混合懸液；空白組以神經(jīng)導管吻合缺損斷端并以生理鹽水充盈導管；自體對照組以自體神經(jīng)束原位翻轉(zhuǎn)180。后吻合缺損斷端,各組樣本量各5只山羊,于后腿單側(cè)建模。術(shù)后觀察8個月并行解剖。比較建模前及術(shù)后8個月神經(jīng)傳導速度。 3.愈合情況評價 術(shù)后8個月行術(shù)區(qū)局部解剖,觀察神經(jīng)束吻合生長情況并測量直徑,取吻合神經(jīng)束行病理檢測及HE、甲苯胺藍染色及抗-S100、抗-Nestin、抗-MAP2、抗-NF、抗-NGF、抗-GFAP免疫組化染色。各染色組進行熒光密度比較,同時比較術(shù)前及術(shù)后8個月神經(jīng)束直徑差。 結(jié)果： 1.成功制備異種生物型神經(jīng)導管,經(jīng)去抗原處理及輻照滅菌后待用； 2.成功建立山羊腓總神經(jīng)4cm缺損模型并以神經(jīng)導管吻合,各組分別添加細胞懸液充盈導管。山羊術(shù)后創(chuàng)口愈合可,未見死亡病例。建模前及局部解剖前分別行神經(jīng)電生理檢測,比較可見術(shù)后神經(jīng)誘發(fā)電位幅度減小。 3.術(shù)后解剖見術(shù)區(qū)神經(jīng)斷端吻合可,未見明顯卡壓及神經(jīng)瘤生成。行病理檢測見新生神經(jīng)束連續(xù)性、完整性可,可見新生神經(jīng)束自斷端發(fā)出向?qū)?cè)生長。 4.術(shù)后吻合神經(jīng)束行免疫組化檢測結(jié)果如下：各組抗-Nestin染色結(jié)果呈陰性；各組抗-S100、抗-NF、抗-GFAP、抗-NGF染色呈陽性,其中混合細胞組及干細胞組較其他2組陽性光點密度具有顯著性差異；各組抗-MAP2染色均為陽性,光點密度無顯著性差異。術(shù)前及術(shù)后8個月神經(jīng)束直徑差值比較可得神經(jīng)干細胞組及混合細胞組差值無差別,上述兩組差值小于空白組及自體吻合組。 結(jié)論： 生物型導管聯(lián)合神經(jīng)干細胞修復外周神經(jīng)缺損安全、有效,較單純以神經(jīng)導管修復外周神經(jīng)缺損效果更佳。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.3

【參考文獻】

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