發(fā)布時(shí)間：2018-02-04 16:05

  本文關(guān)鍵詞： 減阻劑 聚氧化乙烯 超聲造影 缺血 血管新生 作用機(jī)制　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 周圍動(dòng)脈疾病(Peripheral arterial disease,PAD)指外周動(dòng)脈狹窄或閉塞引起的肢體缺血性疾病。主要包括：下肢動(dòng)脈硬化閉塞、糖尿病足、血栓性脈管炎等,是一種較常見的致殘性疾病。隨著我國飲食結(jié)構(gòu)的改變(攝入含脂食物增多)、生活工作節(jié)奏加快、人均壽命延長,PAD發(fā)病率逐年升高,己經(jīng)成為危害人類健康的嚴(yán)重疾病。目前PAD的主要治療手段包括：戒煙調(diào)脂、控制血糖血壓、抗血小板藥物治療等；對于癥狀嚴(yán)重的患者,經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)及外科手術(shù)成為一種治療選擇,但是對于血管病變彌漫、尤其是合并糖尿病的患者往往沒有手術(shù)機(jī)會(huì),仍缺乏令人滿意的治療方法。繼續(xù)探尋新的PAD治療手段有重要的臨床意義及社會(huì)價(jià)值。 血管發(fā)生(neo vascularization)包含血管新生(angiogenesis)和小動(dòng)脈形成(arteriogenesis)。血管新生(angiogenesis)是指血管網(wǎng)上芽生出來毛細(xì)血管,缺血、缺氧能夠促進(jìn)血管新生；而血流切應(yīng)力(fluid shear stress,FSS)是動(dòng)脈生成的一個(gè)重要始動(dòng)因素。FSS是指在血液流動(dòng)方向的切平面上,血液與血管壁之間的相互作用力。在豬急性股動(dòng)脈閉塞的模型中,在閉塞遠(yuǎn)端人為造成動(dòng)-靜脈瘺,可以促進(jìn)更多側(cè)支循環(huán)的建立,在改善局部缺血組織血供明顯優(yōu)于促血管生長因子的作用,這證明缺血組織的血流切應(yīng)力的持續(xù)增加能夠顯著促進(jìn)局部小動(dòng)脈形成。動(dòng)脈生成表現(xiàn)為小動(dòng)脈直徑和數(shù)目的增加,這個(gè)過程是通過內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的增殖而不僅僅是簡單的血管擴(kuò)張,其中肌動(dòng)蛋白Cofilinl和Cofilin2參與平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖,循環(huán)中的單核細(xì)胞對動(dòng)脈生成的過程至關(guān)重要。鑒于血流切應(yīng)力增加是動(dòng)脈生成的一個(gè)重要始動(dòng)因素,那么增加血流切應(yīng)力的藥物將可能是治療組織缺血的一個(gè)重要治療環(huán)節(jié)。 在不改變驅(qū)動(dòng)壓的情況下,向流體中加入極少量的某些高分子聚合物后,流體的粘滯度和密度無明顯改變,但流體阻力明顯降低,流速增加。這種現(xiàn)象稱為Tom's效應(yīng)(Tom's effect),而這些高分子聚合物常被稱為“減阻劑”(Drag reducing polymers,DRPs)。近年來減阻劑在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注,已先后證明減阻劑“聚氧化乙烯(polyethylene,PEO)"能夠明顯減少大鼠血管阻力,增加微動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管的紅細(xì)胞速度。本課題組亦通過聲學(xué)造影證實(shí)PEO可降低大鼠肢體循環(huán)阻力,當(dāng)股動(dòng)脈急性閉塞后,減阻劑仍可明顯改善缺血肢體局部血流灌注狀態(tài)表明DRPs可以提高缺血組織的血供狀況,為急性缺血疾病治療提供新的思路,并為進(jìn)一探討DRPs恢復(fù)慢性缺血組織血供提供了基礎(chǔ)。目前已有實(shí)驗(yàn)證明,減阻劑通過增加血流切應(yīng)力可明顯減少豬、兔等主動(dòng)脈粥樣斑塊的形成,那么它能否通過增加血流切應(yīng)力等途徑促進(jìn)血管新生呢?在血管新生的過程中,DRPs又是通過什么樣的作用機(jī)制來實(shí)現(xiàn)這一過程的呢? 本實(shí)驗(yàn)擬采用大鼠慢性后肢缺血模型,結(jié)合血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測、對比超聲聲學(xué)造影成像技術(shù)及病理、免疫組化、microCT、Real-time PCR及掃描電鏡技術(shù),力圖證明“減阻劑”可促進(jìn)動(dòng)脈生成(arteriogenesis)、改善缺血組織預(yù)后,并探討其可能的機(jī)制,為建立缺血疾病治療新手段奠定基礎(chǔ)。 第一部分減阻劑對大鼠慢性后肢缺血腹主動(dòng)脈血流量及后肢阻力血流動(dòng)力學(xué)的影響 目的 評價(jià)周期性治療后PEO對慢性后肢缺血大鼠腹主動(dòng)脈血流量及后肢循環(huán)阻力的影響,確定減阻的能效關(guān)系,為進(jìn)一步開展減阻劑在慢性給藥模型研究中奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 方法 1.減阻劑的制備 結(jié)合本課題組既往研究基礎(chǔ)及國外相關(guān)研究報(bào)告,本實(shí)驗(yàn)選擇的減阻劑種類為聚氧化乙烯(Polyethylene oxide,PEO,平均分子量為5×106Da)。稱取PEO100mg,加入生理鹽水100ml(濃度為0.1%,即質(zhì)量濃度為1000ppm)：磁力攪拌器置入燒杯中勻速(60r/min)攪拌24h；分子截留量為50000Da的透析袋中透析24h；0.2μm的無菌過濾器過濾細(xì)菌及雜質(zhì)；稀釋為50ppm的溶液備用。 2.動(dòng)物模型的制備 采購大鼠后,適應(yīng)性飼養(yǎng)飼養(yǎng)1周。將實(shí)驗(yàn)大鼠按照完全隨機(jī)的方法分為實(shí)驗(yàn)組及對照組,每組8只。 建立大鼠慢性靜脈給藥模型：3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,右側(cè)頸部切口,分離頸靜脈,插入PE50管約1cm至右心房出口,用探針將PE50管經(jīng)皮下隧道引導(dǎo)至背部切口,固定,1cm的細(xì)鋼絲封堵PE50管末端。分籠飼養(yǎng),每日予肝素生理鹽水(10IU/ml×0.1ml)沖管。 建立大鼠右側(cè)后肢缺血模型：沿大鼠右側(cè)后肢腹股溝韌帶切口,分離股動(dòng)脈及其分支,并以5-0絲線在旋髂淺動(dòng)脈之上雙線結(jié)扎股動(dòng)脈主干,避免傷及靜脈及神經(jīng)。左側(cè)后肢不做處理,作為自身內(nèi)對照。 給藥方式：缺血后當(dāng)日開始在清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下通過頸靜脈通道給藥,隔日一次,連續(xù)給藥21天,實(shí)驗(yàn)組予PEO(50ppm,0.8-1.2ml/h,30min)給藥速度根據(jù)大鼠體重的6%計(jì)算血容量,使血藥濃度達(dá)到2μg/ml,對照組以相同條件給予生理鹽水。 3.血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測 給藥后第21天行腹正中切口,分離腹主動(dòng)脈,安置11ransonic超聲血流儀于髂總動(dòng)脈分叉處上方約5mm處,監(jiān)測腹主動(dòng)脈血流。經(jīng)右側(cè)股動(dòng)、股靜脈逆行插管至髂總動(dòng)脈分叉處,監(jiān)測髂動(dòng)脈及髂靜脈壓力。后肢循環(huán)阻力通過公式：阻力=(髂動(dòng)脈壓力一髂靜脈壓力)/腹主動(dòng)脈血流量,即R=△P/Flow來估算。結(jié)果 1、兩組大鼠腹主動(dòng)脈血流量存在交互效應(yīng)(F=3.076,P=0.000,提示兩組間差異在不同時(shí)間下存在不同；組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.196,P=0.000),提示不同處理組的效果有差異；各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.47,P=0.000)提示在不同時(shí)間下兩組比較血流量不同。 進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)：基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大鼠腹主動(dòng)脈血流量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.47±0.60vs4.47±0.95ml/min,t=0.016,P=0.988).減阻劑組腹主動(dòng)脈血流量在給藥過程中明顯增加,約8min達(dá)到峰值,并維持一個(gè)平臺,隨后緩慢下降,各時(shí)間點(diǎn)血流量變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.995,P=0.000)。鹽水組在給藥過程中腹主動(dòng)脈血流量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.158,P=1.000) 2、兩組大鼠后肢循環(huán)阻力不存在交互效應(yīng)(F=1.117,P=0.359);組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.17,P=0.000),提示不同處理組的效果有差異；各時(shí)間點(diǎn)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.165,P=0.135)提示在不同時(shí)間下后肢循環(huán)阻力沒有顯著性變化。 進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大鼠后肢循環(huán)阻力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.44±0.10Vs0.43±0.04mmHg·min/ml,t=0.29,P=0.78).PEO組減阻效果明顯,后肢循環(huán)阻力在給藥過程明顯降低,約14-18min達(dá)到最大效應(yīng),并維持穩(wěn)定,停藥后緩慢恢復(fù),各時(shí)間點(diǎn)阻力變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.632,P=0.173)。鹽水組在給藥過程中后肢循環(huán)阻力變化不大,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.216,P=0.95)。 結(jié)論 減阻劑PEO能夠增加大鼠慢性缺血后肢模型腹主動(dòng)脈血流量,增加局部血流,同時(shí)降低大鼠后肢循環(huán)阻力。 第二部分：減阻劑對大鼠慢性缺血后肢血管新生的影響 目的 1.應(yīng)用超聲造影評價(jià)微循環(huán)的方法,觀察PEO對慢性缺血骨骼肌微循環(huán)的作用,并結(jié)合病理、免疫組化及microCT技術(shù)從不同角度評價(jià)減阻劑對大鼠慢性下肢缺血模型血管新生的影響。 2.以鹽水組為對照,評價(jià)PEO治療組對缺血肢體毛細(xì)血管和小動(dòng)脈的不同影響,探討血管新生(angiogenesis)和動(dòng)脈形成(arteriogenesis)在PEO促新血管生成過程中的不同作用。 方法 1.減阻劑的制備、動(dòng)物模型的建立及給藥方式同第一章。 2.聲學(xué)造影評價(jià)大鼠后肢骨骼肌微循環(huán)及數(shù)據(jù)分析 使用Sequoia512超聲心動(dòng)圖儀,于術(shù)前0天及術(shù)后第1、7、14、21天行對比超聲評價(jià)大鼠缺血側(cè)后肢的微循環(huán)灌注情況。超聲探頭固定于大鼠后肢中部短軸切面,采用相干脈沖序列成像技術(shù)(coherent pulse sequence,CPS),時(shí)間觸發(fā)成像取圖。連續(xù)錄取造影劑再充盈至穩(wěn)態(tài)過程的全部動(dòng)態(tài)資料。脫機(jī)使用MCE軟件分析圖像,記錄A、p及A×β值。根據(jù)造影劑在局部組織的聲強(qiáng)度與時(shí)間間隔的函數(shù)關(guān)系Y=A(1-e(-β*t))超聲微泡的再灌注充填曲線。造影劑再充填速率(p),反映的是微泡在局部組織毛細(xì)血管流動(dòng)的速度；骨骼肌的平臺聲強(qiáng)度(A),反映的是局部微循環(huán)血流容積；兩者乘積Axp也就反映局部組織血流量。 3.病理學(xué)檢測 于術(shù)前0天,第7天,第14天及第21天分別處死動(dòng)物,取下右側(cè)后肢內(nèi)收肌,行HE染色、α-actin抗體及CD31抗體免疫組化染色。 4. Micro CT血管造影 術(shù)后第21天,對兩組大鼠腹腔麻醉,近端結(jié)扎腹主動(dòng)脈近腎動(dòng)脈側(cè),向遠(yuǎn)端插入PE50管至髂總動(dòng)脈開口處,經(jīng)PE50管向腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端推注硝酸甘油200mg,1min后以60%含碘造影劑(碘海醇)3ml手動(dòng)推入。用中科愷盛公司X-線成像系統(tǒng)對左髂總動(dòng)脈至肢體末端的測值循環(huán)血管進(jìn)行成像。取缺血肢體中部進(jìn)行圖像保存并進(jìn)行定量分析。使用Image J軟件對血管積分進(jìn)行分析,血管積分=缺血側(cè)總造影劑血管充填長度/非缺血側(cè)總造影劑血管充填長度。 結(jié)果 1.PEO組血流灌注恢復(fù)速度顯著快于鹽水組。在第14天時(shí),PEO組的血流量(A×β)恢復(fù)已經(jīng)顯著快于鹽水組(4.94±0.82vs3.46±1.13,t=2.596, P=0.027).治療21天時(shí),PEO組大鼠缺血后肢的血流量高于鹽水對照組,PEO組的血流恢復(fù)到術(shù)前的(90.9±17.9)%,而鹽水組僅恢復(fù)到(73.3±29.4),兩組比較有顯著性差異(5.57±1.15vs4.09±1.04dB/s,t=2.343, P=0.001);骨骼肌血流容積(A)較生理鹽水組各時(shí)間點(diǎn)比較無明顯改變((F=0.045,P=0.836)；血流速度(β)呈現(xiàn)與血流量(A×β)相似變化趨勢,在第14天及21天時(shí)與鹽水組比較明顯升高,分別為和(0.22±0.04vs0.16±0.04s-1, t=2.666, P=0.024)(0.26±0.05vs0.19±0.05s-1,t=2.734, P=0.021)差異有顯著性意義。 2.HE染色提示：大鼠缺血后肢骨骼肌細(xì)胞形態(tài)正常,無充血、水腫,PEO組及鹽水組的骨骼肌細(xì)胞中均有炎癥細(xì)胞浸潤,PEO組炎癥細(xì)胞浸潤細(xì)胞較鹽水組明顯。 3. a-actin免疫組化示PEO組的小動(dòng)脈個(gè)數(shù)在第7天時(shí)與生理鹽水組未見顯著性差異(29.83±6.8vs27.42±5.72,t=0.666, P=0.52),第14天及21天時(shí)較鹽水組增加,分別為(40.78±5.45vs33.01±4.66個(gè)/mm2,t=2.653, P=0.024)和(47.10±6.04vs43.18±6.47個(gè)/mm2,t=2.588,P=0.027) 4.CD31毛細(xì)血管密度提示：治療7天時(shí),PEO組陽性染色毛細(xì)血管數(shù)明顯增加,與術(shù)前相比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(359.17±21.74vs312.33±21.42, P=0.006),術(shù)后14天呈現(xiàn)緩慢回落趨勢,到第21天監(jiān)測A值與術(shù)前相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(314.17±26.19vs312.33±21.42,P=0.906)。生理鹽水組與PEO組毛細(xì)血管密度變化趨勢基本一致。兩組之間各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較未見顯著性差異(P0.05)。 5.‘CT造影示治療21天后,PEO組側(cè)支血管血管積分較生理鹽水組增加(1.42±0.16vs1.16±0.16,t=2.83,P=0.018),兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.PEO能夠促進(jìn)大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注,增加血流速度,結(jié)合病理學(xué)及micro CT下肢血管造影,證明減阻劑PEO可以促進(jìn)缺血后側(cè)支循環(huán)血管形成過程,并可能為治療周圍血管疾病提供了一種的新型安全有效手段。 2.PEO能夠促進(jìn)缺血下肢血管新生,其形式主要通過促進(jìn)小動(dòng)脈生成,而非促進(jìn)毛細(xì)血管新生來這一過程來實(shí)現(xiàn)的。 第三部分減阻劑對慢性大鼠下肢缺血血管新生的可能機(jī)制 目的 采用RT-PCR及掃描電鏡評價(jià)減阻劑PEO對慢性缺血大鼠后肢Cofilinl和Cofilin2基因、單核細(xì)胞粘附因子(MCP-1)及單核細(xì)胞的粘附能力的影響,進(jìn)一步探討PEO促進(jìn)血管新生的可能機(jī)制。 方法 1.減阻劑的制備、動(dòng)物模型的建立及給藥方式同第一章。 2.肌肉Cofilin1mRNA及Cofilin2mRNA表達(dá)的測定 治療第21天后,收集肌肉組織標(biāo)本,Cofilin1mRNA. Cofilin2mRNA的表達(dá)量采用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)進(jìn)行相對定量檢測(以2-△△CT表示)。 3.肌肉MCP-1mRNA表達(dá)的測定同本部分Cofilin1mRNA及Cofilin2mRNA的測定方法。 4.掃描電鏡：治療21天時(shí),取結(jié)扎段以下5mm處動(dòng)脈標(biāo)本,縱行剖開展平生理鹽水沖洗去除表面附著物后,置于戊二醛固定液中,以備制作電鏡標(biāo)本用。掃描電鏡下觀察、拍照。 結(jié)果 1.PEO組肌肉Cofilin1mRNA與生理鹽水組相比較表達(dá)顯著升高(1.81±0.69vs1.00±0.00,t=2.88, P=0.035),兩組比較有顯著性差異。 2.與生理鹽水組相比較PEO組肌肉Cofilin2mRNA的表達(dá)降低(0.64±0.33vs1.00±0.00,t=2.62,P=0.026),兩組比較有顯著性差異。 3.PEO組肌肉MCP-1mRNA與生理鹽水組相比的表達(dá)增加(2.01±0.57vs1.11±0.42,t=3.09,P=0.01),兩組比較有顯著性差異。 4.掃描電鏡示PEO治療組表面見大量單核細(xì)胞粘附,聚集成團(tuán),可見部分單核細(xì)胞侵入內(nèi)膜中層。鹽水組：其表面可見單核細(xì)胞及細(xì)胞碎片粘附,未見成團(tuán)聚集單核細(xì)胞。 結(jié)論 1.減阻劑能夠上調(diào)Cofilin1mRNA的表達(dá),下調(diào)Cofilin2mRNA表達(dá),其促進(jìn)大鼠慢性缺血下肢血管新生的作用可能通過參與平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖,促進(jìn)側(cè)枝血管發(fā)育和成熟的過程。 2.減阻劑可能通過提高切應(yīng)力介導(dǎo)的生物-機(jī)械力作用,作用于內(nèi)皮細(xì)胞,提高M(jìn)CP-1的表達(dá),提高單核細(xì)胞的粘附和侵入能力,以此促進(jìn)血管新生的過程。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡鋒;杜榮生;查道剛;陳向輝;李勝輝;周冰潔;劉伊麗;;聚氧化乙烯對大鼠腹主動(dòng)脈血流量及下肢循環(huán)阻力的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

2 杜榮生;查道剛;周冰潔;胡鋒;紀(jì)麗景;吳爵非;賓建平;劉伊麗;;聚環(huán)氧乙烷對大鼠提睪肌微循環(huán)紅細(xì)胞流速的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年05期

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本文編號：1490590